PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 32  3/4 ‹‹1234››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐

麻瓜[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70075
精华 0
积分 205
帖子 149
信誉分 100
可用分 1516
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-4
状态 离线
21

发表于 2011-8-12 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得引物设计后面的选择固然重要，但是谈的人已经很多了，感觉不用再做重复介绍了。关键是前面碱基序列该如何选择？难道把CDS里的全部搞进去嘛？那要是一个基因两个SNP位点的话，要扩增两个片段，都用这个序列的话，那出来的两对引物还不是一样的了？这肯定不对的呀
顶部
竹蜻蜓[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70432
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1086
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
22

发表于 2011-8-12 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据我的个人经验来看，影响引物能不能用的最大问题是错配问题，建议楼上的朋友将引物BLAST一下。

常规PCR的话，没有错配，一般都是没问题的。

当然，如果对引物要求高的话，就多考虑一些因素好了。
顶部
蒲公英[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70433
精华 0
积分 232
帖子 203
信誉分 100
可用分 1761
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
23

发表于 2011-8-12 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，我用P5设计出来引物后，用Oligo 检测，最后得出的结果是Excessive difference between product and primer melting temperatures.
请问这个影响大吗？我可以用这对引物吗？  
顶部
@木木@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70086
精华 0
积分 222
帖子 183
信誉分 100
可用分 1673
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-4
状态 离线
24

发表于 2011-8-12 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常好，支持！可以帮助理解很多概念问题。
但是，有一点情况没理解，“3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。”
双链的ΔG是指引物和模板链？怎么看的呢？谢谢！
顶部
嗡嗡[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70430
精华 0
积分 168
帖子 75
信誉分 100
可用分 1106
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
25

发表于 2011-8-12 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 @木木@ 于 2011-8-12 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常好，支持！可以帮助理解很多概念问题。
但是，有一点情况没理解，“3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。”
双链的ΔG是 ...

你好，关于你提到的这个问题我现在已经印象模糊了，说实话我现在很少用primer5或者oligo设计引物了，推荐你使用楼上说的软件（其实是一个在线的网站，效果很好），或者使用再上面一点我提到的NCBI里面那个引物设计的程序。因为我觉得这两个地址真的是很不错。

如果真的还搞不定你的问题，我们再讨论ΔG的问题。
顶部
蓝蜗牛[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70420
精华 0
积分 186
帖子 131
信誉分 100
可用分 1386
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
26

发表于 2011-8-12 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用Primer Premier 5.0设计的引物在NCBI上用BLAST没找到我做得基因，这引物能用吗？
顶部
嗡嗡[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70430
精华 0
积分 168
帖子 75
信誉分 100
可用分 1106
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
27

发表于 2011-8-12 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 蓝蜗牛 于 2011-8-12 11:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用Primer Premier 5.0设计的引物在NCBI上用BLAST没找到我做得基因，这引物能用吗？  

鉴于你说的问题，给你推荐一个简单实用的引物设计网址，cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd')

该网站整合了引物设计和序列比对。但愿对你有帮助。
顶部
大仙[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70436
精华 0
积分 178
帖子 116
信誉分 100
可用分 1291
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
28

发表于 2011-8-12 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教LZ一个问题！
我将做的的是rt-pcr，在设计引物遇到想不通的地方：师兄做的是检测细胞中IL10的表达，通过genebank查找到mRNA其cds，用primer5设计好引物，扩增序列为173bp:而我做的是从细胞中通过rt-pcr扩增后，胶回收转染腺病毒。
1，问题是我能否用他设计的引物？用的话，问题是他做的扩增后只是一段DNA（才173BP），只是检测表达水平！而我做转染要求的是IL10基因的完整cDNA序列？
2，以上实验引物设计的有没区别，各自设计的不同在哪？应该根据什么来设计？（不是问引物设计后检测的11法则）

大家见笑了，实在是不懂！郁闷中！！！不懂就问！先谢谢大家了！
顶部
小米虫子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70163
精华 0
积分 155
帖子 70
信誉分 100
可用分 1081
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-5
状态 离线
29

发表于 2011-8-12 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好，我想设计微卫星引物，多重PCR。不知道可以用什么软件来设计引物？
顶部
橘子水儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70058
精华 0
积分 183
帖子 106
信誉分 100
可用分 1296
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-4
状态 离线
30

发表于 2011-8-12 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢搂主的好贴，能否帮忙设计一下实时定量PCR引物和探针啊。序列在附件里。下面是我自己用Primerexpress 设计的，不知道有没有错！扩了两次没有结果。
Name: LFA-IgG.txt-542F
Sequence: GCGTGGAGGTGCATAATGC

Name: LFA-IgG.txt-607R
Sequence: CCACACGGTACGTGCTGTTG

and the TaqMan probe:

Name: LFA-IgG.txt-565T
Sequence: ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG（G含量比C多，故用互补链）
5’JOE-CTGCTCCTCCCGCGGCTTTGT-3’TAMRA
顶部
 32  3/4 ‹‹1234››