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标题:做完荧光定量后如何统计数据【转自 丁香园论坛】

大仙[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近在做Real-time PCR 相对定量基因表达，我用的是AppliedBiosystem 公司的机器和软件，我有一个问题想请教您一下：
比如我做不同时间点 0h, 3h,6h, 24h 的某个基因表达量的相对变化，也就是说以0h为calibritor, 3h,6h, 24h 相对0h 的变化量。一般每个时间点设三个重复，但是三个重复的样品的值不可能是完全一样的，有时候差异还很大，在分析时是选 0h-1, 0h-2, 0h-3 三个样品中的一个作为calibritor , 也就是设它的值为1，其它两个的值可能大于1 也可能小于1 ，假设0h-2为 0.7 ，0h-3为1.2， 那么，如果我选0h-2 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都升高了，同样，如果选0h-3 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都降低了。那么我的问题是到底选哪个作为calibritor 呢。多谢了！
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发表于 2011-8-12 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我筛选了两个内参基因，都做了定量实验，可是现在该如何来处理目的基因的定量数据呢？  
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大虾米[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的有癌组织，癌旁组织，正常组织（N1-N10），每组有10例，每例3个重复，那样的话我分析的时候，应该用哪个做calibritor？N1或是N2或是10个的均数？若是用均数怎么在软件上设呢？用的是ABI7500，谢谢各位！
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？
最近查看了相关的资料。就楼上说的问题，给点参考意见如下：
我现在使用的伯乐的real－timePCR仪器。其处理数据的软件中有关几个内参基因的数据处理是这样的：
1.目的基因的相对表达量计算和一个内参时是一样的，即以下的公式（附件一）；
2.多个内参时候的标化计算方法见附件二；
3.整个文件见附件三。由于考虑到部分战友不一定能很顺利的打开整个文件，所以把其中的两个公式分别发到了以上两个附件中。
希望能对你有所帮助。
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有个问题,我做的是绝对定量~得出拷贝值的数据后,用本帖中的方法1双曲线法计算基因差异性,如图,但是将浓度改成拷贝数!

然后又用双delta 方法计算.使用实际扩增效率,即Pfaffi法.

但是得出的两组结果却差别比较大,我很困惑,有哪位朋友遇见过这样的问题吗?我觉得两种方法计算出的结果应该不会差别很大呀~计算的结果数据如下:

A ........ .......... B
1: 0.595 ........ 1.267
2: 0.893 ........ 1.044
3: 0.521 ........ 0.526
4: 0.798 ........ 0.550
5: 1.91 ........ 1.41
6: 1.05 ........ 0.669

其中A是用得双曲线法(将浓度改为拷贝数计算)
B用的 2 -delta delta Ct 方法

感觉两组结果相差挺大,又使用按实际扩增效率计算的Pfaffi法,结果又会变化为:
1: 0.96
2: 0.99
3: 1.11
4: 1.10
5: 1.01
6: 1.05
同样的标本,同样的反应,用不同方法分析的基因表达差异性,怎么有的样本相差这么多呢?
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饭团团[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不需要那么复杂吧。一般考虑两种方法。

一是标准曲线法。在内参基因和目标基因扩增效率不一致的情况下，每次实验都带上两个基因的标准曲线，根据标准曲线推断扩增的量。

二是delta delta Ct法。如果内参基因和目标基因扩增效率一致，那么对于一个sample1，用（X1=目标基因Ct值-内参基因Ct值）进行标准化。比较不同sample时，用标准化后的值，即Xi间的差值进行比较，如（Y=X1-X2)。最后转化成RNA水平实际变化倍数时（sample1相对于sample2），只要N=2^Y就可以了。

建议楼主查看一下这篇文献，主要讲的是delta delta Ct的原理。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8.

其实我觉得最重要的是内参基因的选择，这是判断RNA水平有无显著变化的关键。我不建议楼主使用GADPH，虽然也能勉强接受。最好是用18S rRNA，这是“金标准”。 而且目的基因和内参基因的片段大小最好在300bp以内，这样无论是扩增效率还是准确性都要好很多。我用的是Takara的试剂盒，结果稳定，效果不错，条件允许楼主可以试一试。

最后关于数据的可信度。一般认为用real-time PCR，其数值变化在50%以内都可以认为没有显著差异，但也有意见认为这个浮动应该控制在20%以内。还有就是每个样品的复孔，最终结果相差0.5个Ct值可以接受，否则就要作为坏值而剔除。

以上意见有些是PCR仪的仪器工程师在讲座中提到的，有的是文献中报道的，有些是我做实验的经验，也有些是试剂公司网站提供的。供楼主参考
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如影随形[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我准备近期做REAL TIME PCR，看完各位高手的分析后，有两个问题噢：
一是：是不是用2-ΔCT的方法就不用参照物呢，直接用处理前后的样品来比较？
二是：用质粒来制作双标准曲线的时候，如果我的样品处理前后的片断是一样的话，那么就是使用同一个质粒来制作标准曲线，这样子就只用一个标准曲线了，就失去了标准曲线相对定量的意义了啊？
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2-ΔCT的方法由于没有内参基因校正,误差很大,不建议使用.
双标准曲线是目标基因和内参基因两条标准曲线,narcissuszxb只用一个标准曲线,我不明白了.
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 椰子叶子 于 2011-8-12 15:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
2-ΔCT的方法由于没有内参基因校正,误差很大,不建议使用.
双标准曲线是目标基因和内参基因两条标准曲线,narcissuszxb只用一个标准曲线,我不明白了.  

Pfaffi法中要是对照组和处理组中目的基因的扩增效率E不同的话咋办呀？？
请问楼上各位如何解决这个问题？？
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许愿精灵[使用道具]
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发表于 2011-8-12 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要检测某种疾病中A基因的表达与正常人中A基因的表达是否有差异,已经得出该种疾病50例以及正常人5例中A基因的CT值,用 2-ΔΔCT怎么统计患者与正常人中A基因的表达是否有差异.请各位战友指教
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