小中大关注这个话题很久了，但是大家好像没有说出个什么明确的思路。
我最近也在处理PCR的数据，就相对定量方法说说我的一些理解和看法。
1.我们的目的：研究一种或者是多种干预对一种疾病（现象）的影响。那么相对定量就需要得出我们的目的基因在某一种（多种）样品中的表达量相对于对照样品的上调（下调）倍数。这是对研究的终极目的－－－统计学上的总体而言。
2.实际操作：我们研究常常是对一个样本进行的。这里就需要从我们研究的样本数据经过统计分析而实现对终极目的的推断。
3.具体的操作：上面好多的战友都说了几种方法，都是有道理的，但是还是说的很粗略。包括我在学位论文数据库中检索了国内多所所谓的“牛”校他们的数据处理方法都是五花八门。而且你很难得看的明白具体的思路！！
例如：20只大鼠随机等分为两组，干预组以“善宁”治疗，对照组不用任何处理。观察“善宁”对肝脏中目的基因白介素－1（IL-1）的mRNA表达的影响。我们的终极目的就是想得到“善宁”是上调（下调）该基因表达的疗效。而此处20只大鼠仅仅是一个样本。要得到这个终极目标，就要用这20只大鼠的样本统计量去统计推断总体参数，才能实现这个终极目标。我们选用B-actin作为内参基因。
前提：目的基因和内参基因的扩增效率和相关系数要满足不同分析方法的前提。不需多说，上面的战友说的很多了。
那么
首先，干预组和对照组中，IL-1基因在相同的样品（肝脏）中的表达需要用内参基因B-actin归一化（人为的假定为“1”）。主要是消除我们取材时候“量”的差异（不能保证相同的细胞数）。
其次，（“善宁”）干预措施的效果是相对（没有处理）而言的，就是说从基因表达角度看，应该理解为：经过干预后，目的基因的表达是上调（下调）了。反应在数据上就是相对于对照样品，干预样品的目的基因上调（下调）了多少倍（这就是“相对”定量的确切含义）。此处就是以对照样品目的基因的表达量再一次的归一化。而实际上，如果在此用对照样品目的基因IL-1的表达量进行归一化处理（人为的假定为“1”），我们就只能得到这10只“善宁”干预组大鼠相对与没有任何处理的对照组的10只大鼠的目的基因IL-1的表达的倍数关系（对样本而言），还不能就说“善宁”能上调（下调）IL-1基因表达。还需要进一步的统计分析才能这样说！因为这一结论是我们的终极目的（对总体而言）。那么此处是两组样本的比较就可以选择t检验达到统计推断的目的。（当然如果是多组的比较可以选择单因素方差分析）。
而恰恰在进行统计推断时，我们面临一个问题！是什么呢？就是我们能得到“善宁”干预组肝脏中IL-1基因相对与对照组的表达倍数的一组数值（10个数据），可是要完成t检验就还需要对照组的另外10个数据，此处我们已经把对照组的IL-1的表达量假定为“1”了，总不能以均数为“1”，标准差为“0”进行统计分析吧！怎么办呢？比较好的办法就是：在上面进行对照组的归一化处理时，我们是用对照组的目的基因IL-1表达的“均数”来假定为“1”的。因此，可以以这个“均数”再次归一化处理对照组中不同样品的IL-1的表达量。这样就可以得到10个数据（此时“均数”不是10个“1”，标注差也不是10个“0”）。以此就可以完成统计分析了。
其实我们大可不必完成后两种归一化处理。直接把“善宁”干预组和“未处理”对照组中已经经过内参归一化处理的目的基因IL-1的表达量（此处的表达量是各个组织中的目的基因“绝对”表达量）进行t检验，得出我们要的结论------“善宁”是否上调（下调）IL-1的表达。
这里，需要说明的是：因为相对定量是相对而言的，所以在进行实验操作时“一定”要把各个样品一一对应起来，这样得出的CT值才能够进行相关的数据处理。理解也很简单，就是说干预组中1号样品的目的基因就必须和1号样品的内参基因的CT值进行相关数据处理，不能把1号样品的目的基因的CT值和2号样品的内参基因CT值进行数据处理！假如这样做就没有起到“归一化”的作用！但是，在用对照组的的目的基因来归一化处理干预组的目的基因时就需要把所有的对照组的目的基因的表达考虑进去了。否则不能得出干预的效果。这也是把对照组目的基因表达的“均数”用来归一化处理干预组目的基因表达的原因。
说了这么多，不知道对大家有没有帮助。请大家指正！
