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标题:做完荧光定量后如何统计数据【转自 丁香园论坛】

飞天小鹿[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近上了几次定量，做的标准曲线，发现扩增效率一直上不去，总在百分之80

几，R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的，扩增效率都是百分之九十几，我又连做了2次，很认

真，很仔细，操作上也没太大问题，并且样品用的和以前一样，只是样品都又稀释了10

倍，但扩增效率就是上不去。这是怎么回事呀，希望有经验者能帮忙分析下可能造成这

个结果的原因，好进一步纠正~~~~谢谢~~~~
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小困[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请高人指点：如何求ddCT值的SD，及其P值大小
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：我做的实验是析因设计，基因含量检测我做荧光定量PCR，用的染料法，得出的数据（mRNA相对含量的计算用目的mRNA的Ct值减去内参的Ct值得到△Ct，以最大的△Ct作为基准，用其他△Ct减去最大的△Ct并取结果的负值，得到-△△Ct，求得2的-△△Ct次方的结果作为mRNA的相对表达量），用析因设计怎么分析？能举个实例是最好。谢谢了
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发表于 2011-8-12 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说说自己对数据计算的方法吧。
在说计算方法之前，说明一下，荧光定量的数据是指一个处理中至少有三个样本，每个样本四次重复的数据。
实验完成后，仪器会给出48个数据，12个对照样本目的基因的Ct，12个对照样本内参基因的Ct，12个处理样本目的基因的Ct，12个处理样本内参基因的Ct。接下拉算出每一个样本的平均目的基因和内参基因的平均Ct值和SD，这时的SD值来评判复孔的误差；接下来，利用每个样本内参基因和目的基因的平均Ct值（三个样本）分别计算出处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值和SD，这时的SD值中包括了样本个体间的差异。接下来，利用处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值相减分别得到处理组和对照组delta Ct，这时的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方。delta delta Ct值即为处理组delta Ct值减去对照组delta Ct值，标准差与处理组的delta Ct值计算时的标准差相同。最后将上下限的delta delta CT值算出，得到最终的倍数。  
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发表于 2011-8-12 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
按照delta,delta方法计算，是不是，control组的值都是1呀？但是我看到很多的文献里面用这种方法的，他们的control往往都不是1？
不知这个如何解？
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小米虫子[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前段时间研究了相对定量的几种分析方法,个人认为,虽然标准曲线法最早出现也比较经典,但和2ΔΔCt法一样存在扩增效率可信度的问题.
1.2ΔΔCt法默认扩增效率为100%,实际上扩增效率往往在80%~120%之间,从这个角度来说,标准曲线计算出的扩增效率要比用2更准确些;
2.从另一个角度来看,也是一直以来的一个困惑,我认为扩增曲线从起峰开始到达到平台期的循环数,即扩增曲线在拐点处的曲度,体现了反应体系的扩增能力,也就是扩增效率.但从多次实验结果来看,一组曲度很大的扩增曲线(从扩增开始到达到平台期大概7个循环左右)和曲度很小的标扩增曲线(扩增曲线从扩增开始缓缓的上升,始终达不到平台期),在通过标准曲线计算扩增效率时,往往是接近的,差异最多也就是10%左右,远远没有扩增曲线体现的那么明显,从这个角度来说,标准曲线法和2ΔΔCt法的差异也就在相对定量的表达差异是(1+E)ΔΔCt,即1.8ΔΔCt左右还是2ΔΔCt.
除非有另一种新方法,否则在我看来,这两种方法差别不大.  
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发表于 2011-8-12 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在正在做Real time PCR，使用折是Takara Cycler Dice TP800
之前复习了一下资料，结合现在做的实时，与大家分享一下体会：
1.定量的方法有两种：2－△△Ct法和标准曲线法。就我总结相关论文而言，2－△△Ct法要求比较的各基因的扩增效率相同，从实际上来说，即使结果出来，也会受到很多质疑——你为什么使用2－△△Ct，请给出扩增效率的证据来！因此虽然2－△△Ct法可以免去做标准曲线的步骤，但结果的可信度会较标准曲线法降低。而且2－△△Ct法在Takara软件上可以直接计算出结果，如果有人像我这样不是基础专业，只要知道结果是怎么样的，为什么用这样的方法，这就足够了，而不用具体去运算。
2.标准曲线法，可能大家觉的很麻烦。我制作这相对简单，我采用在Real time PCR扩增的产物，如果产物不纯，溶解曲线有多个峰，经过凝胶电泳后可切割下来目的基因的扩增band，用QIAquick Gel Purification Kit将产物纯化并提高浓度。如果溶解曲线只有峰并经电泳证实PCR产物只有目的长度的band，我用QIAquick PCR Purification Kit直接纯化PCR产物。然后用PCR产物纯化后的DNA按10的倍数稀释制作标准曲线，一般纯化后的，我使用的稀释浓度由10的4次方至10的9次方。直线相关非常完美，然后用这个标准曲线定量。用此方法制造标准曲线的方法就是可以节省cDNA模板和得到最高浓度的DNA以制作标准曲线。然后Real time PCR上带的软件可以自动给出相对定量值等。只有代入SPSS进行方差分析或t检验就可以了。
总之，为了省略可信度的质疑，我建议采用标准曲线，标准曲线可以采用Real time PCR的产物纯化后制作。
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如影随形[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
REST （the Relative Expression Software Tool）软件, 该软件根据公式amount of target = 2-ΔΔCT的基本原理进行运算，但可以同时使用多个内参照基因和分析多个目的基因，并且允许看家基因和目的基因有不同扩增效率，可以进行精确的运算和统计检验。
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问2-ΔΔCT中,-ΔΔCT是2的-ΔΔCT幂次方计算，还是按2减去ΔΔCT来计算呢？  
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天蓝蓝[使用道具]
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发表于 2011-8-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般而言，荧光定量PCR在无须得到精确的数值时是可以采用2的-ΔΔCT幂次方计算进行简便计算。但是前提是两者的扩增效率应该一致。所以在引物设计和片段的扩增长度应该大致一样，约50-150bp左右。一般实验室中对于荧光定量PCR做多个片段扩增，为省钱采用sybr green方法，这只是相对粗略计算，完全可用sybr green方法代替探针精确定量。
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