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标题:【求助】荧光定量PCR的标准曲线怎么做？

泡泡[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR的标准曲线怎么做？


我现在的实验是用SYBR Green I 荧光定量PCR检测样本基因表达的差异，不知道是用
逆转录的cDNA还是用PCR产物做标准曲线好？
请各位大虾指导！
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zhy平平[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好把cDNA克隆到质粒中去,然后用质粒来作标准曲线,
也可以不做标准曲线,用比较CT来进行相对定量,结果也不错,如果想要这方面的资料的法,我有
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dior[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也可以使用内标。
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zhy平平[使用道具]
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 小中大
请问，你有相对定量内标法的相关资料吗，我现在做的是这个方面的，但是不知如何进行数据处理，可以发给我写资料吗？
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cbou876[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将看家基因和目的基因在同一管中扩增的话，实验条件有什么要求
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发表于 2015-7-1 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的建议，如果不用质粒DNA，则需要用纯化的PCR产物。但是质粒DNA为首选。
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发表于 2015-7-1 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

采用相对法定量要求必须目的基因和内参具有相同的扩增效率,所以需要做efficiency curve如果得到的斜率小于0.1,可以采用相对法,否则,需要重新设计能达到相同扩增效率的引物,或者就需要制作标准曲线,制作标准曲线,可以将基因片段克隆到质粒,然后体外转录成RNA,定量以后合成cDNA,然后按比例稀释后做出标准曲线,或者可以采用一个一直质量好的RNA样品,如细胞株,然后以此为标准制作.如果直接采用DNA做标准,那前提是RNA逆转录的效率一致.
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以用外参照做实时荧光定量 ，用一定梯度的阳性对照 制作标准曲线！
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用国家标准品呀，笨！！
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3N4G[使用道具]
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发表于 2015-7-1 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最好把cDNA克隆到质粒中去,然后用质粒来作标准曲线,
也可以不做标准曲线,用比较CT来进行相对定量,结果也不错,如果想要这方面的资料的法,我有
请问能给我一份这个资料吗？我的mail：franzhf@163.com, 3Q
我是做real-time的，标准品已经送公司做好了，马上要做标准曲线看看，但是我对这方面不是很了解，所以先谢谢楼上的这位大哥了！
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