PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于RNA琼脂糖电泳的方法和详细步骤

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】关于RNA琼脂糖电泳的方法和详细步骤

bgf5[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76186
精华 1
积分 430
帖子 435
信誉分 102
可用分 3111
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
1
 

【求助】关于RNA琼脂糖电泳的方法和详细步骤


急请教关于RNA琼脂糖电泳的方法和详细步骤,本人是新手,以前没有做过,希望有好人帮忙!!
顶部
yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
2
 

琼脂糖凝胶电泳
  琼脂糖凝胶电泳技术(Agarose gel electroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
  【材料】
  1.琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液(40m MTris ,20 mM NaAc,1mM EDTA PH8.0)
  2.载体缓冲液(0.25%溴酚蓝,30%甘油)、溴化乙锭水溶液(10mg/ml )
  3.凝胶槽、电泳仪
  【方法】
  1.取琼脂糖0.9g,加入100ml 1x TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,1000C加热溶解。
  2.平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5~1mm)。
  3.铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml 的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至500C左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5~8mm。
  4.待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负极端,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2~3mm,小心拔出梳子。
  5.DNA 样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出)。
  6.打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm。
  7.据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5s RNA和0.3 kb DNA
8.电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。
rna与此大同,只是其更易降解,操作要小心.
顶部
bangqi_k[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114509
精华 0
积分 254
帖子 247
信誉分 100
可用分 1967
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
3
 

实验书上说是要用甲醛变性的。可是一般就是用非变性的,比较方便,不过之前电泳槽要用3%的双氧水处理一下,然后用无水乙醇洗一下,后面 就和一般的电泳没有什么分别了
顶部
bgf5[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76186
精华 1
积分 430
帖子 435
信誉分 102
可用分 3111
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
4
 

相关疾病:
头痛
对呀,就是看到书上说是用甲醛变性,觉得麻烦,缓冲液的配制就够头疼的了,那如上面的师兄所言,用非变性的方法,就是可以和DNA电泳用一样的电泳缓冲液和载样缓冲液吗?谢谢了
顶部
bangqi_k[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114509
精华 0
积分 254
帖子 247
信誉分 100
可用分 1967
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
5
 

回复 #4 bgf5 的帖子

是的,我们跑rna时也没进行甲醛变性,就是用DNA电泳的电泳缓冲液和载样缓冲液,而且也没有用3%的双氧水等处理,也能跑出来,不过小心一点还是好的。
顶部
bgf5[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76186
精华 1
积分 430
帖子 435
信誉分 102
可用分 3111
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6
 

谢谢了,那我就注意把条件处理好些。
顶部
wawa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71235
精华 0
积分 440
帖子 560
信誉分 100
可用分 3618
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
7
 

看了以上几位的介绍,有些疑问,我也跑过RNA电泳,按照平常DNA电泳的条件跑过但是就是跑不出来,RNA溶液我是加样了3ul,是不是我提取的RNA量不高呢?
顶部
bangqi_k[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114509
精华 0
积分 254
帖子 247
信誉分 100
可用分 1967
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
8
 

有可能的,你可以把电泳槽洗一洗,加大rna上样量,如果还不行,就可能是rna提取的不太好,只有重新提了。
顶部
qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
9
 
请教各位高手几个问题:
1.因为实验室条件不好,电泳槽只有一个,是公用的,而且电泳缓冲液和琼脂糖等都是公用的。别人一般用来做pcr产物的电泳鉴定。我想做rna的琼脂糖凝胶电泳,我用DEPC处理过的水来配置TBE液,电泳槽也用双氧水处理,应该对他们的电泳没什么影响是吧?
2.但是他们用来跑PCR产物,对我的电泳会不会有影响?也就是说他们加的样品会不会弥散到电泳缓冲液里面去,对我的样品有污染。
3.有人要做质粒的大提鉴定,中间要用到RNA酶,他提取出来的质粒DNA中会不会残留RNA酶?
4.跑电泳的时候不加MARKER行不行?因为实验室里没人做,买RNA MARKER太贵了,只想看看是不是能跑出比较和条件的条带来。
5.上样缓冲液必须得加吗?只用溴酚兰不行吗?
多谢各位!
顶部
mickeylin[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79369
精华 0
积分 461
帖子 582
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
10
 

先回答第一个问题:你的DEPC水高压消毒了吗,如去毒了那就对别人应该没有什么影响。
第二个问题:有可能对你的实验结果有一定的影响,因为他们跑PCR产物,那些产物不可能没有全部都在琼脂糖上,总有一些会弥散到缓冲液里,而且缓冲液不是经常更换的,反复的PCR产物电泳必然会造成RNA酶的污染,你也不是每次跑电泳就更换缓冲液和清洗电泳槽的,是吧。
第三个问题:其实回答你第二个问题就提到了这个问题,就不谈了。
第四个问题:MAKER相当于一个标尺,是参照,没有它,你跑出来的条带再漂亮,你也说明不了什么问题,那你说拿什么来比较呢。
第五个问题:上样缓冲液当然要加,也不麻烦,你不会告诉我配40%的蔗糖溶液都嫌麻烦吧。
顶部