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标题:【求助】我的引物退火温度怎么算？

hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的引物退火温度怎么算？


S（正义链） 5'-GACATGGGGTATTGGAT-3'
A （反义链） 5'-TCCATCCCATACCAGCA-3'
用于pcr时退火温度大概多少？
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hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的引物是用的文献上面的，根据文献描述退火温度是55度，可是我pcr出来非特异性条带比我要的条带还亮而且出现很多非特异性的带，我该怎么调整呢？
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是自己摸一下吧 有条带很好了 我一点都没有
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发表于 2015-7-1 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

计算退火温度的方法：
1. 退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便。
2.用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。
3.合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。
我认为方法二最准确，不知道还有其他方法吗？
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

i am more worse than you, no any belt appear for 5 days. thus make me exhausted .
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发表于 2015-7-1 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

every one, good night i have have a sense chain and anti-sense chain need a expert to give me a hand.
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发表于 2015-7-1 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、你没发现你这对引物之间可以配对么GGGTAT和CCCATA
所以建议提高退火温度看看效果如何
2、应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C
3、降低Mg离子和引物的用量
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是开始防暑假就开始做rt-pcr，到先在没啥满意结果（晕啊！） 曾经在8月7号出了几条480bp得条带，确实让我高兴一下，但是第二天以同样得体系和同样得退火温度.模板一样，除了引物二聚体外，啥也没有，实在没办法，昨天做内参，出来了，说明模板还没坏吧？体系内得 东西我们实验室其他人也做啊，说明也没坏吧？昨天上午请一位有做得多得姐做了，也是没结果啊！，下午又把引物重新配过了，我根本没加内参引物，到是批出几条在内参250bp得条带来，真弄不懂啊！
我在别人得实验做，八月低就要结速啊！没办法，请各位大侠分析一下吧，小妹先谢谢师哥师姐了！！！
今天又不知出啥带了？
几次出带下来，感觉pcr得重复性太差了啊！
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果按楼上说得方法，我的primer 给我的引物退火温度是57.9和59.5度，在加2到3度，都要成61度了，又这么高的退火温度吗？？
刚出道不久，请各位指点啊！
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2015-7-1 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物为20mer以上时：
Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L
其中L为引物的长度。这是计算引物的Tm。一般情况退火温度比引物的Tm低五度左右，不过要根据自己的情况摸索条件。祝你成功！
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