PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】大家PCR时引物终浓度一般选多少？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】大家PCR时引物终浓度一般选多少？

memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
1

发表于 2015-7-1 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大家PCR时引物终浓度一般选多少？


我是定的公司的引物，单子上是说每OD加25微升水稀释到200UMOL/L，实际中大家稀释的终浓度是多少？谢谢！
顶部
tewank[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114488
精华 1
积分 229
帖子 173
信誉分 102
可用分 1561
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
2

发表于 2015-7-1 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10umol/L
顶部
zzzz[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74598
精华 1
积分 656
帖子 967
信誉分 102
可用分 5638
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
3

发表于 2015-7-1 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般是配成保存液为50uM，
工作液就是将两个引物1：1一对，也就是25uM
使用时加1ul混合引物于25ul体系，也就是终浓度1uM，好记好算
不过不一定浓度合适，有时还需摸索
祝好！
顶部
zzzz[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74598
精华 1
积分 656
帖子 967
信誉分 102
可用分 5638
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
4

发表于 2015-7-1 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10uM好像比较常用
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
5

发表于 2015-7-1 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物浓度过高会出现什么情况，我是用的20UM，谢谢回复
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
6

发表于 2015-7-1 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面的图是我昨天的结果，我是把我师姐已经做好的课题的引物拿来做预实验。反应体系及条件都是用她的。
RT步骤：
硫酸镁 2微升
BUFFER 5微升
去酶水 0.75微升
dNTP 0.5微升
RNase 0.25微升
BCA 0.5微升
OLIGO 0.5微升
mRNA 0.5微升
PCR步骤：
硫酸镁 1.2微升
BCA BUFFER 4微升
灭菌蒸馏水 11.3微升
Tag 0.1微升
上游引物 0.5微升
下游引物 0.5微升
内参正义 0.2微升
内参反义 0.2微升
CDNA 2微升
逆转录反应条件65度1分钟，30度5分钟，65度15-30分钟，98度5分钟，5度5分钟。
PCR反应条件：94度5分钟，94度30秒，52度30秒，72度1分钟，35个循环。72度5分钟，4度保存。
电泳是0.5XTBE 30ML加琼脂糖0.5G，100V电泳30分钟。
我的引物是340BP，内参是500BP
不知道为什么我的电泳会是这样的结果，都歪了，相当难看，而且目的条带没有，请各位大侠帮帮小弟！


查看积分策略说明
附件
2015-7-1 22:08
68779072.jpg (9.1 KB)
 
顶部
大海啊故乡[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108867
精华 0
积分 193
帖子 125
信誉分 100
可用分 1275
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
7

发表于 2015-7-1 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

容易形成引物二聚体，就不易与目的片段发生退火。。。。
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
8

发表于 2015-7-1 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那您觉得20UM浓度算不算高呢？
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
9

发表于 2015-7-1 22:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SmallDonkey wrote:
>不一定，要看使用的浓度、情况，还有不同的片段也不一样，模版不同差别也比较大(质粒最容易，基因组和cDNA则各有特点)
>
> 你使用时加多少？好像没有我加的多，应该问题不大
>
> only01 wrote:
> >那您觉得20UM浓度算不算高呢？
>
>
我的目的条带是340BP，内参是500BP，我用的引物浓度是20UM。一般内参跑出来而目的条带没出来主要是什么原因，模板？还是引物？谢谢回复
内参出来说明模板质量没有问题，酶没有问题，PCR体系基本没有问题
可能的原因：
1。目的条带的引物设计，不过你的由于已经有人做出来，应该不是
2。模板中目的片段的丰度，你是用基因组作模板还是cDNA?若是基因组也就没这个问题
3。退火温度，可能需要摸一个梯度条件
4。模板浓度，内参虽然出来，但可能是适用于该基因，也许也要摸个浓度梯度
PCR的影响因素很多，具体会是什么原因不好判断，建议做好重复和对照，这样每次的实验结果才有意义
祝好！
> 我的目的条带是340BP，内参是500BP，我用的引物浓度是20UM。一般内参跑出来而目的条带没出来主要是什么原因，模板？还是引物？谢谢回复
不用定量，做个倍比稀释，1-10000倍稀释，找几个稀释度就行
> > 我是用的CDNA，不知道您说的模板浓度如何去摸，我这里没有RNA定量，提了RNA后直接加20微升DEPC备用的，没有测浓度
顶部
子衿青青[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103467
精华 0
积分 212
帖子 164
信誉分 100
可用分 1556
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
10

发表于 2015-7-1 22:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tewank 于 2015-7-1 22:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

10umol/L

uM和μM是不是一样啊请问？
顶部
 13  1/2 12››