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标题:【讨论帖】大家来跟贴说说自己内参基因不稳定的情况吧!

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其实很多研究者不管三七二十一,就RT-PCR了。
殊不知,他们得到的均一条带,一半以上来自于基因组 和/或 假基因。
其实RNA应该DNase消化干净基因组!再RT-PCR。

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常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理,其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物,该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面,而中间待扩增的区域被内含子隔开,这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物,看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理,其实这一步大可不必。不过,要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因,测序才是最好的方法咯。
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至于单个内参基因到底适不适合用来做qPCR的比对标准,我觉得要分开对待。如果你的一批样品本身生长差异不大,而且未受到外界的胁迫作用,那么我认为使用单个内参基因的结果是可信,比如actin、GAPDH之类的,大胆使用就是了。但是,如果在你待研究的这批样品里面,本身就是处在不同生长时期或是受到外界不同时间段的胁迫处理,我的观点是,如果你选择单个内参基因来作为比对标准,你一定要提交绝对定量的结果验证你的这个内参基因确实表达不变,否则可能你的实验结果是假的(当然不是说你人为造假)。其实有很多时候,我们是无法找到绝对表达不变的单个基因用来作为比对的标准的,这个时候,多参照基因的选择就是绝对必须的了。可惜,很少在园子里看到这方面的讨论,抑或是目前好点杂志的审稿人都还未认识到这个问题的严重性吧。其实这个问题在2002年就有人提出了,他们把这方面的工作做得非常出色了,给大家参考两篇相关的文献:
1、Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology.
2、qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biology.
特别是第一篇,我认为基本上在很多年内都可以成为qPCR的最权威的选择标准了。
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常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理,其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物,该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面,而中间待扩增的区域被内含子隔开,这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物,看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理,其实这一步大可不必。不过,要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因,测序才是最好的方法咯。

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"常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理" 不知道你提取RNA后是否进行过检测,如果没有的话,就不要轻易下结论,免得误导大家。
我们的经验是无论你用多么高级的TRIzol,总会有DNA的残留,需要DNase处理!!!
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"常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理" 不知道你提取RNA后是否进行过检测,如果没有的话,就不要轻易下结论,免得误导大家。
我们的经验是无论你用多么高级的TRIzol,总会有DNA的残留,需要DNase处理!!!

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抽提手法和技术不过关,用得着在这里探讨吗。
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我在实验中很少确信我的材料用Trizol提取的RNA没有DNA的残留,我一定会用DNase处理的。此外要想真的确保没有基因组残留就要在有内含子的基因两侧设计引物,PCR看条带或者qPCR溶解峰是否单一。
如果做绝对定量还是要现做这个实验检测自己的样本的。否则对于表达量很低的基因怎么确定是基因组来源还是你的RNA呢?
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zhezhe[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 bring 于 2015-7-1 22:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理,其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物,该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个 ...

很遗憾,即使象Ambion这样专门的RNA公司都认为
“All RNA Isolation Methods Yield RNA Containing Residual Genomic DNA.
Ambion has found that no RNA isolation method consistently produces RNA free of residual genomic DNA.”
详见cuturl('http://www.ambion.com/techlib/tn/95/9513.html')
确实设计跨内含子的引物是一个很好的办法,但是所跨的内含子要比较长才行,否则不能作Realtime定量,因为基因组污染所导致的长片段同样会影响定量的值。
有人认为rRNA作为内参基因还不错,包括作miRNA时候用的5S,普通RT用的18S,28S。缺点就是丰度比较高
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yayya[使用道具]
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原帖由 zhezhe 于 2015-7-1 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在实验中很少确信我的材料用Trizol提取的RNA没有DNA的残留,我一定会用DNase处理的。此外要想真的确保没有基因组残留就要在有内含子的基因两侧设计引物,PCR看条带或者qPCR溶解峰是否单一。
如果做绝对定量还是要现做 ...

对,任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染,关键之处就在于这种痕量的DNA污染是不是会影响到后续的实验。设计一对看家基因,引物本身位于两个不同的外显子上未被内含子隔开,但是扩增区域被内含子隔开(最好相隔100bp-200bp),这样一对看家基因的引物就是mRNA和基因组都可以通用的引物,只不过扩增大小不一样,反转后的产物拿这对引物去扩增或是做溶解曲线,如果只有一条带或是单峰,则说明痕量的DNA污染根本就不是你考虑的重点:因为它根本就未影响到你后续的实验。但是如果出现双带或是双峰,那就说明你必须要用DNase去消化你的样品了,不过在我抽提过的几百份植物各个部位的RNA材料里面,只要抽提手法过关,是根本不需要用DNase消化这个步骤的,如果你技术不过关,乖乖的用DNase来处理。要不要选择DNase,完全取决于个人的技术和手法,而与TRizol无关,所以针对到底用不用DNase的讨论其实是非常无聊的东西,呵呵!见仁见智吧。
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对于不同的发育期可能内参基因的表达也有不同吧,建议做试验前先做个预试验,看看到底哪个基因更适合做为内参。
如【Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early
chicken embryological development】cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T5X-4TWSRP3-2&_user=1154139&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000051814&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1154139&md5=c58071213f00c136c3c99b8c0edd1337')
文献中认为Ribosomal Protein L7 (RPL7) 在鸡胚胎发育过程中表达比ACTB, GAPDH, 28S, 和LDHA稳定。
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既然“任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染”,那么为什么要投入精力物力去证明它是否影响后续实验?仅仅为了证明那么点DNA是否影响后续实验就去设计引物再反转录再去扩增或是做溶解曲线,实在是浪费啊,哪有那么多时间和财力什么的,DNase处理也就40分钟的事情,花费也不多。
做实验前充分查阅文献,了解相关研究中使用的内参情况,结合自己或者师兄师姐(多咨询一下就好)的经验来做。再就做好预实验,选好了内参。我们一直都是用GAPDH的,做RT-PCR 时都设置复孔,从结果中就能了解到你加样的准确性,取平均值来分析结果,反正都是计算机自动处理,相对来说结果的可信度就高一点。
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原帖由 yayya 于 2015-7-1 22:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对,任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染,关键之处就在于这种痕量的DNA污染是不是会影响到后续的实验。设计一对看家基因,引物本身位于两个不同的外显子上未被内含子隔开,但是扩增区域 ...

师兄是生科院的吧?
我的感觉若是有money的话 还是买qgien的盒子就可以,什么问题就解决了。
其实就是用trizol提取很难保证没有点点的DNA污染的,不过我在验证这点DNA的影响的时候我是倍比稀释的, 所有内参和目的基因在5%variance内并且溶解曲线也不错,我就认为没有影响。结果的重复性很好。
再逆转以前步骤越多耗时越长,后面的结果越不好说------
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