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标题:【讨论帖】大家来跟贴说说自己内参基因不稳定的情况吧!

+田田+[使用道具]
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相关疾病:
头痛
顺便请教大家,我在用DNase(promega产品DNaseI)消化RNA中的DNA时,有时即使过夜也无法消化DNA,有时消化会把DNA,RNA全部消化掉,电泳看不到条带,一直很困惑不知道是什么原因?我提RNA较多了,不是新手,现在倾向 havocking 兄所说的,尽量在提取手法上多注意,pcr检测RNA看是否有污染我才进行后续的工作,但在处理污染的DNA上一直令我头痛。各位不知道有什么好经验没有。
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+田田+[使用道具]
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常规的TRIZol试剂抽提RNA,已经足以消除DNA的混入了,不需要再使用DNase来处理,其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物,该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面,而中间待扩增的区域被内含子隔开,这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物,看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理,其实这一步大可不必。不过,要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因,测序才是最好的方法咯。

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所言及是。通过因物完全可以解决这个问题
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+田田+[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 +田田+ 于 2015-7-1 22:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病:
头痛
顺便请教大家,我在用DNase(promega产品DNaseI)消化RNA中的DNA时,有时即使过夜也无法消化DNA,有时消化会把DNA,RNA全部消化掉,电泳看不到条带,一直很困惑不知道是什么原因?我提RNA较多了,不是新手,现在倾向 havock ...

这根本不是问题,把你的基因和primer 给我,我给你看看
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DDD[使用道具]
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最近看的一片文章
cuturl('http://www.springerlink.com/content/p20k12vm054326ur/')
有关管家基因在不同处理条件下的水平变化
影响因子不太高,但也能说明一些问题了
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最近遇到这样一个现象,将某蛋白的表达载体转染入293T细胞后,想通过qRTPCR看看该蛋白对某microRNA的量的影响。结果,做出的结果是:microRNA的Ct值组间未有明显差异,作为内参的U6的Ct值却明显降低(转染了目的蛋白的组)。
难道U6真的也不可靠?
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xue258[使用道具]
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关于DNA污染,我在国外的实验室,这里罗嗦两句
先简单介绍下老外的做法
用TRIZOl提RNA,然后用QIAGEN的minieasy 盒子纯化,加上QIAGEN的DNase盒子消化。测OD值,经过TRIZOl提取后比值1.9,经过上述折腾后比值一般不超过1.7。经过这样的提法,大概国内没几个实验室消费的起。
qiagen的说明书上写,一般按照他们的程序提可以去掉大多数DNA。我开始按老外的做,后来实在受不了,有一段时间我每天60个样本的RNA,怎么可能这样做?
于是我按照Qiagen说明书做,没有做DNase消化,但我做real time的时候通常加一个样品,这个样品里面是不加逆转录酶的。经过比较,扩增后基因组dna的影响小于0.5%。
因此我觉得用试剂盒提,然后注意操作是可以不用DNase消化的
另外,建议一下,如果你实在不放心,可以用qiagen的plus的盒子,这个盒子里面多一个柱子,可以高盐去除dna,仅仅多一步15秒的离心而已。
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关于DNA污染,我在国外的实验室,这里罗嗦两句
先简单介绍下老外的做法
用TRIZOl提RNA,然后用QIAGEN的minieasy 盒子纯化,加上QIAGEN的DNase盒子消化。测OD值,经过TRIZOl提取后比值1.9,经过上述折腾后比值一般不超过1.7。经过这样的提法,大概国内没几个实验室消费的起。
qiagen的说明书上写,一般按照他们的程序提可以去掉大多数DNA。我开始按老外的做,后来实在受不了,有一段时间我每天60个样本的RNA,怎么可能这样做?
于是我按照Qiagen说明书做,没有做DNase消化,但我做real time的时候通常加一个样品,这个样品里面是不加逆转录酶的。经过比较,扩增后基因组dna的影响小于0.5%。
因此我觉得用试剂盒提,然后注意操作是可以不用DNase消化的
另外,建议一下,如果你实在不放心,可以用qiagen的plus的盒子,这个盒子里面多一个柱子,可以高盐去除dna,仅仅多一步15秒的离心而已。
......

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我是用invetrogen的Trisol,没用试剂盒。但因为提的组织很微量,怕DNA酶消化过了反倒不好。听说用注射器针头反复吹吸也可以将DNA弄断,但从没试过。
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chengjie79[使用道具]
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我想请问下L19做qPCR的内参是什么原理啊?
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