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标题:【分享帖】基因启动子区 甲基化引物设计心得

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发表于 2015-7-2 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('www.methdb.de')
推荐战友们访问此网站，以及此网站提供的一系列甲基化相关工具网站的连接，有帮助于解决上述战友的问题。
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发表于 2015-7-2 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在当前国内浮躁的学术环境下，我不认为有几个人可以耐心的去设计优化出一个针对特定位点的MSP甲基化分析系统。即使国外设计好的MSP系统，其稳定的运行，得出有意义的科学的数据，不但需要严谨的精神，高额的耗费，而且需要高超的实验技术。MSP的难度，最好是普通PCR具备相当基础后再涉足此领域。BSP难度稍低点，也仅仅是比MSP稍低了点。占有们应有足够准备。
我实验引物多用在线软件Methprimer设计。
BSP测序数据用BiQAnalyzer分析。该软件下载安装后使用，需要JAVA。
二者均可从cuturl('www.methdb.de')找到连接。
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发表于 2015-7-2 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上，我做了个基因的BSP，运气比较好，目的基因出结果了，送去测序，但不知道如何分析测序结果，不知有没有什么软件分析的，还有测序图如何看
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发表于 2015-7-2 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上，我做了个基因的BSP，运气比较好，目的基因出结果了，送去测序，但不知道如何分析测序结果，不知有没有什么软件分析的，还有测序图如何看，请教了
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发表于 2015-7-2 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是BSP产物直接测序,还是克隆后测序? 两者的意义是不同的. 我做的是克隆后挑单克隆测序. BiQAnalyzer分析。该软件下载安装后使用，需要JAVA。
可从cuturl('www.methdb.de')找到下载连接。
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发表于 2015-7-2 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

aifuhong ,我是BSP产物直接测序，请问如何看测序图
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发表于 2015-7-2 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BSP产物直接测序 测的是许多甲基化情况不同的分子的混合体, 就我所知, 目前还没有专门针对此结果分析的软件. 需要自己对公司交付的测序图( 电子版的用测序结果的看图软件打开)进行分析, 看原来CpG位点是C还是T, 亦或者是C/T双峰, 及双峰高度的相对比例, 作出人工的CpG位点甲基化情况判断.
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发表于 2015-7-2 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面是本人博士论文中对直接测序结果分析的描述:
将测序结果去除引物，用在线程序MethBlast粗略分析与目的序列的同源性和甲基化情况，然后人工分析每个CpG二核苷酸位点的测序峰图，判断有无甲基化及其大致比例。本法依赖测序峰来识别甲基化和非甲基化，对样品中的低水平甲基化可能无法反映出来，也无法获得混合组织中少数异常细胞的甲基化谱。
附图说明一个CpG二核苷酸位点为双峰, 说明在该位点部分分子为甲基化,部分分子为非甲基化,


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发表于 2015-7-2 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

甲基化研究的方法问题, 至今缺乏稳固的根基. 即使公认的可以接受的方法, 仍然 经不起严格的考问. 这也就是美国人较浪漫的欧洲人较少研究甲基化的原因.
对于 MSP法, 95%和5%的甲基化, 结果是没有质的差别的. 个人认为, MSP系统,始终应该伴有质量控制标准品的检测, 即应把完全甲基化和完全没有甲基化的DNA与样品DNA同步处理修饰和扩增, 只有阳性和阴性控制的结果都正确时, 样品的结果才有意义. 测序, 无论是BSP直接法,还是克隆后,对于5%的甲基化或非甲基化都可能反映不出来.
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发表于 2015-7-2 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
MSP首先是一种等位基因特异性PCR技术（ASP），而即使针对基因组DNA的
ASP技术（如SNP分型），都是非常容易出现假阳性、假阴性的，对反应体系、循环参数、操作等的要求非常严格。MSP引物针对修饰后的3.2碱基组成的基因组设计，又要如你所知的种种考虑，引物的选择余地很小，很难设计出高效、特异的MSP引物。修饰后的DNA又量小质差。所以整个MSP系统就象一根竖在桌子上的筷子。你可以找到那个平衡点，把筷子竖立起来，但一点微风就可以令其倒下。明天你就不一定能重复今天的结果。
其次，基因组DNA的修饰，转化率95%就是达标的，对于国人来说，甚至是优秀的。如此，对于MSP法结果分析来说，是致命的。5%的非转化，足够MSP显现阳性结果了。顺便说一句，转化率的评价方法本身就是受到质疑的。国人，无论是用试剂盒，还是自配转化试剂，很少有人去考虑转化率的。
再次，DNA的甲基化修饰，本身就不是绝对的。可以认为，100%甲基化几乎是不存在的。加以肿瘤细胞增殖活跃，基因组复制频频，营养供给不良，甲基化作为有序的耗能过程，其维持能力应是下降的。那怕你用的是单克隆细胞系，细胞之间都有甲基化异质性存在。
再次，组织特异性是基因组甲基化谱的基本特征，检材往往是多种细胞的混合体。即使是所谓的微切割技术，都是难免有其它细胞基因组污染的。
说了一大堆，甲基化还是值得研究的，非常有意义的。只是说我们应该以严谨的、科学的方法去研究。在还没有更好的方法时，应以严谨的、科学的态度去分析实验结果。
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