小中大【转帖】【分享帖】SSCP检测SNP原理，步骤及常见问题
SSCP原理：sscp称为单链构象多态性，它是基于DNA构象来检测PCR产物单链碱基微小差异的方法，因其检测敏感，快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响，如：PCR产物，温度，电压，PAGE胶的浓度和交联度等，因而重复性比较差。因此在做SSCP时要注意各种条件的一致性。如果有酶切位点的话最好用RFLP方法检测DNA 多态，或是用SSCP与RFLP两种方法相结合，试验结果要更加可靠些。
SSCP的主要试验步骤：
1. PCR扩增目的基因片段。
2. 制备PAGE（聚丙烯酰胺）胶。不同长度的基因片段用不同浓度和交联度的胶，常用 的有19：1，29：1，39：1（丙烯酰胺：甲叉），浓度有8％，10％，12％的。
3. PAGE胶的灌制。将配好的PAGE胶混匀，立即灌至干净的玻璃板中，插上梳子于室温聚合1－2小时。
4. PCR产物的变性及电泳。取1－2ulPCR产物加5ul变性缓冲液，95度水浴或放置PCR仪上变性10分钟，立即拿出冰浴，迅速上样于非变性的PAGE胶，以1×TBE作缓冲液，在一定温度下电泳。根据待测片段的长度调整电压和电泳时间。
5. PAGE胶的染色。一般采用银染的方法，具体方法很多，查查作这方面的文章就知道了。基本上包括染色，显色，停显及观察结果（判型）几个步骤。
其中比较重要的是PAGE胶的交联度和浓度的选择，这要通过反复的试验进行比较，从而选择最佳条件。另外温度也要控制好，有的说要最好在4度冰箱中跑电泳，但我们实验室的基本都是在室温条件下跑电泳，结果也还可以。
一些参考数据
1、电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
2、靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。
因为目的片段越长其单链的泳动速度越慢，大于400bp的目的片断不但检出率低而且泳动速度极慢，所以建议楼主不要做sscp为好。
我们实验室的步骤如下（在以上主要试验步骤做修改）：
pcr产物好了后，按1：1各10ul得产物和变性上样液，在pcr仪上95度变性5分钟，要立即骤冷（准备好的冰浴）10分钟，加样。恒功率20W，我们的槽子是25cm的伯乐！一般200bp，恒温7度，5各小时就好了。(注意pcr产物一定要好，和maker中最亮的一样！）
我们试验室做SNP用的是如下仪器：
1。PTC-200的PCR仪（扩增、变性都用他）
2。水平电泳槽（鉴定PCR产物）
3。BIO-RAD universal mutation detection system 垂直电泳槽（变性后的产物检测）
4。恒温水域器（保持电泳的温度在4－6度）
5。凝胶成像系统（GENE公司)
以上就是我们试验的做SNP的仪器，别的小的仪器就不一一说明了。
说明一下优缺点：
1。变性，我们是95度10分钟，和做PCR扩增一样。用PCR仪可以保证温度、时间的准确。如果用水域锅，就要防止体系的挥发和变性温度的准确。
2。做SNP一定要保证PCR产物的浓度好，所以当然用琼脂糖鉴定了。如果浓度够，在变性鉴定时，单链浓度就更小，将导致无法鉴定！
3。恒温，做SNP要保持电泳槽恒温，一般在4－6度。如果温度高，对鉴定有影响。如温度高，条带跑的快，无法达到预期的单链和双链分开！
