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标题:【求助】请教定点突变引物设计

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-7-2 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教定点突变引物设计


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46XX性发育睾丸疾病
各位兄弟姐妹，俺是第一次做定点突变，以下是我的目的序列，蓝色字体的是我的目的序列，也就是我要扩增的序列，从181到2475；红色标记的碱基AAC,AAT,我都想突变为CAG，请各位给我帮助，实验室以前也没有做的，请各位给些意见了，最好稍微详细的一步一步的，听说还要两次PCR,设计5对引物啊。真是不明白啊。5‘端是Hand3的酶切位点，下个5’的酶切位点ECorI。谢谢啦。
5’
121 gctaaaacat tgcacaggag aagtcggcct gagtggtgcg gcgctcggga cccaccagca
181 atgctgctct tcgtgctcac ctgcctgctg gcggtcttcc cagccatctc cacgaagagt
――――――――――――――――――――――――――――――――
361 agaggtggct gcataaccct catctcctcg gagggctacg tctccagcaa atatgcaggc
421 agggctAACc tcaccaactt cccggagAAC ggcacatttg tggtgaacat tgcccagctg
481 agccaggatg actccgggcg ctacaagtgt ggcctgggca tcaatagccg aggcctgtcc
541 tttgatgtca gcctggaggt cagccagggt cctgggctcc taAATgacac taaagtctac
601 acagtggacc tgggcagaac ggtgaccatc aactgccctt tcaagactga gaatgctcaa
661 aagaggaagt ccttgtacaa gcagataggc ctgtaccctg tgctggtcat cgactccagt
721 ggttatgtaa atcccAACta tacaggaaga atacgccttg atattcaggg tactggccag――――――――――――――――――――――――――――――――
2401 atggcctaca aagacttcct gctccagtcc agcaccgtgg ccgccgaggc ccaggacggc
2461 ccccaggaag cctagacggt gtcgccgcct gctccctgca cccatgacaa tcaccttcag
3’
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发表于 2015-7-2 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Overlap PCR介导突变是最简单易行的方法，成本也很低。请参见分子克隆第十三章。
大致说下做法。每个突变点需要合成一对相互Overlap（重叠）20－25bp的突变引物，你的试验中需合成4对（4个点）突变引物。 另外两侧需要合成一对引物，以便扩增全长序列（称为全长引物）。
举一突变点为例，如需突变A点。先作两个PCR：1使用正向全长引物和A突变点的反向突变引物；2突变点A的正向突变引物和全长反向引物。而后回收两段PCR产物，取少量产物在PCR体系中先自延伸十周，而后加入正向和反向全长引物扩增全片断。回收第二轮的PCR产物，酶切，接入克隆载体，测序。测序结果如正确则第一个位点突变完成。 以此类推，突变剩下的位点。
但是这种方法效率较低，老老实实作的话，一次引入一个点突变，如你试验中需要引入四个点，每次突变克隆引入一点，至少需要约4周时间。
可以取捷径突变PCR得到全长序列后，不进行酶切和接入载体，而是把该PCR产物作模板，继续上诉突变步骤，所有点突变完后在接入载体并测序挑正确克隆。 缺点是PCR过程会引入突变，累计效应难以估计（我自己没这么干过，上次突变了四个点，一个一个老老实实做的。用了3个月。如果还要作突变，我也许会试试这条捷径）。
你课题中还要考虑的一个问题是：全长片断为2K左右，最好不作2K的全长PCR。这四个突变点集中在400－500bp范围内，全长引物最好设计包括这一范围的400－600bp。在这一范围内作所有的突变。而后使用适当的酶切位点同后面的1K多的片断相连接。 因为如果把全长引物设计到整个片断（2K）的两端，每次都要扩增如此大的片断，会增加突变的几率。
QuickChange是一个比较成功的突变试剂盒，可考虑。好像还可以同时引入多个突变点，建议你查查。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-7-2 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是按照您的方法来设计引物做的，合成了10段引物（5对），我今天做了第一次PCR,发现八个片段PCR作出来7个片段，跑电泳也非常好看，但是另一个怎么也做不出来。在电泳孔道里只有跑在最前面的100bp左右的一团稍亮的带。不知道是不是引物二聚体，不知道如何改条件才行，希望给予指导。谢谢！
我圈出来的那个孔的对比marker是在最右边，分别是从上到下是100，250，500，750，1000，2000bp,
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发表于 2015-7-2 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不客气，很愿意能够提供一些参考信息。
为了说明方便，全长正向引物称为FF（Full Foward），例如从361碱基开始；全长反向引物称为FR（Full Reverse ），例如从2401碱基开始。从上游到下游，突变点分别为A、B、C、D。每个突变点的一对引物，正向的为字母大写即A、B、C、D引物，反向为字母大写并标一撇，即A' 、B'、 C'、 D'引物。
扩增成功的是四个较短的片断，分别是FF同A' 、B'、 C'、 D'引物的扩增产物。而扩增较长片断时，RF同某个引物的扩增失败（B或C？），其他扩增正常。（从你的胶图上看，上样孔在下方。离上样孔近的条带应该是大片断，未扩增成功的是在扩大片断的半块胶上，位置约1000bp，不会是引物二聚体，引物二聚体通常在100bp左右，和溴酚兰位置接近）。
扩增失败的PCR可以进行条件优化，如改变退火温度（看来要降一些），延长退火时间（有力于失败的那条引物退火）等。 你的其他组结果都很好，我认为问题出在退火温度不合适或退火时间偏短。 摸条件我的做法是先用普通Taq酶配200微升PCR混合液，分装10管，每管一个温度，连续摸数个到十个温度，取条带扩增最锐利的为最优条件。
但是我认为还是需要提醒你的是FF到RF之间的扩增片断有2K，这会增加PCR引入突变的几率。我还是建议FF到RF之间取600bp左右作突变PCR，而后用适当的酶切位点连接。当然如果你必须扩增2K的片断，这个意见不是绝对的，因为象QuickChange试剂盒，实际上对整个3K的质粒序列扩增，并用引物引入突变，也是成熟的技术。
还有一点个人经验。要注意原始DNA污染后面的突变过程。需要原始DNA作模板时，模板量尽量少些。切胶回收PCR产物时，一定要用洗涤剂清洗电泳槽而后作回收电泳。切胶在紫外灯下进行时，要把胶接触的平面用分别含酒精、NaOH（消除核酸）、清水的三块干净纸巾擦干净。
建议突变PCR只循环20周，以降低PCR引入突变的几率。
还可借鉴不对称PCR可以富集一条产物链的特点，两引物可一个高浓度，一个低浓度，使有能延伸的那个单链富集些。例如进行A点突变，第一轮两管PCR中，1. FF引物正常量，A'引物1/5正常量；2. A引物正常量，RF引物1/5量。（不可按不对称PCR 50:1的比例加引物，因为扩增成的单链难以结合EB，因而难以回收）个人感觉这样的方法可以增加突变的成功率。
祝顺利！
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 小中大
非常感谢，我会按照您的建议去实验的。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-7-2 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我现在按照您的指导和建议，已经做到二次PCR了，并且切胶回收了。下面我就要酶切连接了，但是我们实验室没有做过的，我第一个得摸索，不知道步骤啊，Hand3和Ecor1这两个酶和BUffer我们实验室都刚刚买的，是Fermentas公司的。我就想知道从酶切，连接，到酶切验证和PCR验证，再到测序，中间这个过程如何操作，希望您给予建议，最好有每一步的建议和详细步骤，十分感谢了，您的联系方式是什么？我联系也比较方便啊，谢谢！您可以在我原来的帖子里回答，说不定会是个精华帖呢，你的经验太丰富，这可以从你给我建议里看出来。希望您有空可以帮帮我。第一次做啊，一头雾水，谢谢！
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 小中大

关于酶切、酶连、转化等一套分子克隆中的问题，我把我们实验室一套成熟的做法加以整理，已经贴在园子里。你可先参考其中PCR克隆和转化部分的内容。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=6008019&sty=1&tpg=3&age=0')
一个PCR克隆酶切用量的实例：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=5963558&sty=3')
以上主要是我个人的意见，尽量提供实用的操作Protocol，其中的原理讨论较少。所以请一定搜索和多看园子里的帖子。克隆技术方面有很多帖子。请参考核酸版、生化分子生物版、PCR技术版等。
关于PCR酶切，请参考该精华贴：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=940309&sty=1&tpg=1&age=-1')
祝顺利！
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