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标题:【求助】半定量RT-PCR究竟能不能准确定量

yonger[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】半定量RT-PCR究竟能不能准确定量


      做RT-PCR的人确实很多，我也算是做了近8个月了，做出的条带虽然非常的漂亮，但感想是，这项技术定性还凑和，半定量就不行了。首先是内对照和目的基因之间多少存在竞争，其比值本身就不宜定量；第二，结果不能重复，我做了很多次，发现相同的RNA、不同RT-PCR产物的半定量结果极不稳定，就算是同一管PCR产物，扫胶后结果也各不相同，甚至可能差别很大。
       因此鄙人愚见，这一方法不宜定量，以后各位同仁要是想在RNA水平进行定量的话，real-time定量RT-PCR和Northern blot也许是更好的选择，毕竟花了大量的经费和时间啊，希望各位老师能一起讨论一下这个问题。
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

realtime好贵的！
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vcve[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

仅仅定量，做个斑点杂交就可以了。我觉得比Northern方便准确，因为Northern过程中RNA降解是在所难免的，多少会有点。斑点时间短，操作容易呀。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一点，NORTHERN和DOT不是都能用的，如果你的目的蛋白基因表达很少，只能用PCR，而且要发文章，REAL TIME才好说话。是贵，也是无法替代的。
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tudou85[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是半定量我已经做完了
但是统计方法实在搞不清用什么，哪位高手指点一二！
谢谢了！
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我老板让我探讨一个酶在病理情况下的表达变化,因为此酶的抗体找不着,我就用RT-PCR的方法探讨其在转录水平表达的变化.做了后,我才发现结果不稳定,且影响因素太多.现在是浪费了金钱和时间依然没有结论.所以,建议大家今后做RT-PCR前慎重考虑.如果你只是想定性分析,RT-PCR尚可;但定量,最好选用及时定量PCR.
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发表于 2015-7-2 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
      使用RT-PCR半定量，那么首先您需要多重复几次（最少3次），然后将目的基因和内对照的比值以均值+/-标准差的形式记录下来；其次要看您的实验设计了，象foliage兄探讨一个酶在病理情况下的表达变化，如果是3种不同的病理情况，则每个病理情况下都需要做至少3次RT-PCR，记录目的基因和内对照的比值，采用方差分析法（多半是正态分布计量资料）比较不同病理情况下的比值不同，比较同一病理情况下不同时间的变化也是如此；如果是比较大的样本，如40个肺癌标本，采用RT-PCR法检测VEGF和FGF的表达情况，然后比较它们的相关性，可采用直线相关法（偏态资料采用秩相关分析）。
       当然还有其他情况 ，小弟在统计方法方面小有研究，如果您有什么问题，可以跟帖讲清楚一点您的实验设计和目的，大家一起讨论。
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发表于 2015-7-2 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在用分析RT-PCR条带的图象分析软件时，操作者的主观性也是影响结果客观准确的一个重要方面。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚查悄悄话才发现您的回复，不好意思
我在其它文献中也有见用均值+/-标准差的方式表示的，可就是不懂：既然是目的基因和内对照的比值就应该是以几何均数表示，怎么求其均值呢？
twig兄讲的也很有道理
多谢两位指教
注：我是新手，不要称为兄吧。
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yonger[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因和内对照的比值就应该是以几何均数表示，怎么求其均值呢

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      没想到一个月以前的帖子还能再看到，我记得这个帖子是我在专业版块中得到的第一分，真是美好的回忆！再次感谢主任！
      谁说新手就不能称为兄了，其实每个人都各有所长，您在其他方面说不定就比我们强很多呢，而且，我进实验室还不到1年，也得算新手。
      现在就您的问题讨论一下：
      1.您怎么会想到几何均数的？平均数（average)包括算术均数（简称均数）和几何均数，二者都是重要的集中趋势指标。算术均数主要用于表示正态分布资料的集中趋势，几何均数主要用于表示某些偏态分布资料的集中趋势，后者主要包括两种情况，一是等比数列资料，即各变量之间呈倍数或近似倍数关系时，如抗体的滴度等；二是对数正态分布的资料，如疾病潜伏期等。目的基因和内对照的比值您看符合这两种情况吗？
      2.由于半定量RT-PCR这项技术不能准确定量，因此要多重复几次，所得的结果才最接近真值，最少也得3次，重复的越多，结论肯定也更准确。根据个人经验，我认为目的基因和内对照的比值尽管有所变动，有时侯甚至挺大，但总体来说还应该认为是正态资料，所以用算术均数+/-标准差的形式来表示我觉得比较合适。
       您觉得我说的有道理吗？若否，请跟帖讨论。
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