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标题:【求助】反转录时该选用oligo dT还是 随机6引物？

爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】反转录时该选用oligo dT还是 随机6引物？


不太明白什么时候选用oligo dT，什么时候选用随机引物, 求指点
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zzzz[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾，且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT；但如果你的目的mRNA没有playA尾或者你的基因较大时，由于RT酶的扩增能力问题就要用随机引物啦。
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one[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上正解，还有如果您希望得到全长的CDNA，就应该选用oligo dT。再有调取特异片段的时候反转录还可以使用下游特异性引物的。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

oligo(dt)与哺乳动物mRNA的3‘端ploy（A）尾巴序列互补，其特异性要比随机引物高；但随机引物能与mRNA中许多位点互补，当mRNA序列很长或者包含许多二级结构时候建议用随机引物。
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dior[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

去听了一个公司的专业讲座（公司名字就不说了，以免有广告之嫌），讲的是定量PCR的“标准”。其中有建议说，定量PCR之前的RNA逆转录过程中，最好将Oligo-dT和随机引物混合使用，会提高逆转录的效率，也使结果更加客观和稳定。原理很简单，RNA提取过程中可能有部分RNA轻微降解，无PolyA 尾。还有一些基因的mRNA很长，有随机引物的掺入，会加大扩增出全长的效率。两种引物各有优缺点，因此，混用可以取二者之长。
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ztonyc[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上可以详细的讲讲吗？第一次听说，谢谢。
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baidukk[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也是第一次听说二者混用，不过听起来很有道理，有没有具体的资料？
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发表于 2015-7-2 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是公司内部研发的资料中的，是讲荧光定量PCR国际化标准（MIQE）的讲义。中间提到的前期关于RNA逆转录过程的要点。整个讲义主要是基于下面这篇英文文章（下面会附上）。但我看了一遍，里面没有直接提到我上面提到的。因此，我把我拿到的讲义上面的话抄下来：
“在反转录步骤中，关键的是抽提的RNA样品能够连贯完整的基因组。一些基因长度很长，但这些序列的RT产物长度不足，特别是在RT引物只是和每个mRNA末端配对时。使用mRNA末端配对引物和mRNA序列随机位点配对引物的组合会得到每个基因的反转录产物群。此方法比单一的末端或随机位点配对转录本更具有代表性，可对转录基因组进行更好的覆盖。”
此观点没有提供来源出处，仅供大家参考
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cbou876[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关键的量的问题没有提到啊，是不两个引物各加原来的一般就行还是加原量。！！！
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nn255[使用道具]
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发表于 2015-7-2 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提供一个产品说明书中的反应液配制吧：
5×PrimeScript Buffer 2.0ul
Random 6 mers(100uM) 0.5ul
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5ul
Oligo dT Primer(50uM) 0.5ul
Total RNA ×ul
RNase Free dH2O up to 10ul
Total 10ul
10ul的反应体积最大使用500ng的Total RNA。
但是我做逆转录10ul体系，加入1000ng的RNA也OK。
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