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标题:【求助】融合PCR

zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分别P出来的片段回收了的，我现在准备通过酶切位点的方法相连．那么我想再问问．可以三片段一起连吗？？就是两个小片段．加载体．放一个体系里面连．
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lgm[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以的。最好先过夜连接，第二天早上再补点酶，然后下午转化。不要用平头的。载体要选短点的。记得做自连的对照。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的三个酶分别是：EcoRI和BamHI, BamHI和NotI,我的载体是pPIC9K，有９千多ＢＰ，您看能一起连吗？另外您能帮我看一下能不能分别双酶切呢？我用ＮＥＢ的酶，但找不到共用Ｂuffer ....我好害怕切不下来，连不上，因为我的模板快用完了，再ＰＣＲ我怕就没有了．....问题好象很多呢
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发表于 2015-7-2 21:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是想做酵母表达吗？你用BamH1酶切，不是把信号肽也切了吗？
你还是重选一个载体吧，比如pUC、pBlu。你最好先把两个片断分别连到载体上，然后从载体上把片断切下来，再连到载体上。这样做更加容易些，因为直接用PCR产物酶切连载体效率不高，何况是三个连。我以前三个片断连就是这样连上的。
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standbyme[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

双酶切还是一起切的好。你选buffer不一定要求每个酶多是100活性，活性有20-50%也可以了。NEB酶不错。
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发表于 2015-7-2 21:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

线粒体007大侠你好,我最近也在做重组PCR,为了把1560bP和861bp的两个目的片段连接起来,我前面已经分别扩增出两个目的基因并已经胶回收,这两天在跑第二轮PCR,也就是用P1和P4为引物去跑,PCR结果有出现目的条带,但是特异性不是很强,反而是在1200处有个非目的条带很亮,这种情况下我该改变什么条件进行优化,以提高我目的产物的特异性呢?希望能给予指导,万分感谢!!!
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我是NEB（北京）的技术支持。
EcoRI和BamHI, BamHI和NotI可以双酶切。
EcoRI和BamHI用EcoRI的buffer，BamHI和NotI用BamHI的buffer就可以了，关于双酶切，您可以用Double Digest Finder软件，网址为cuturl('http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp?')使用很方便。
连接可以用16度过夜，如果不放心，可以高浓度T4，您先试试
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,我想问一下,BamH1和Hind111,BamH1和Xbal1可以一起双酶切吗,还是要分步来,它们有无共同的缓冲液?谢谢
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发表于 2015-7-2 21:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下,BamHI和HindIII,BamHI和XbalI能不能一起双酶切?它们有无共同的缓冲液?还是要分步酶切,谢谢!
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baidukk[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你能不能把你第二轮PCR说得详细一点。还有你重叠区的长度。最好附张图
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