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线粒体大侠,我的引物是这么设计的:A基因：
上游与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
上游：5’ CCCAAGCTT ACCATGGATGTCGTCGAGCAGC 3’ 31
下游：5’ GTAGCCGACCGCCATAATGGAAGC GATGGTCTTCTGCTTCTTGGG 3’ 45
B基因：
上游与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
上游：5’ CCCAAGAAGCAGAAGACCATCGCTTCC ATTATGGCGGTCGGCTAC 3’ 45
下游 5’GCTCTAGA TCAGGCAGCGCGCTGC 3’ 24
每条引物空格前为酶切位点和保护碱基或用于融合的互补区,其中互补区最后六个为引入的接头,其余前面的为B头或A尾的互补序列(上面文字中的说明).第二论PCR我采用的条件为:94度4min,94度1min,55度1min,72度2min,5个循环,然后94度1min,65度1min,72度2min,28个循环,72度10min.
