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标题:【求助】融合PCR

dmg[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Q1：按照我的经验，你这么长的片段很难在酵母里表达，何况你的序列也没有药酵母密码子优化。建议你还是在原核表达，应该可以表达的。
Q3：酵母表达操作也不是很难，用PPIC9K是可以用G418筛选高拷贝的重组子，通常情况下，有1－10%的高拷贝重组子，如果你用2mg/ml的G418筛选可以从数万个重组子中筛选出几十个高拷贝的。
Q2：无法回答。
另外：建议还是找一个短点的载体。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我就是因为片段太长，所以害怕在原核里面表达不了．另外，我想干脆两种一起做，你看呢...　...　
１.　但是我不知道如果我在原核里面表达，我用什么载体好点呢？
２.　我没有G418，而且担心那种抗生素有点贵，怕老板不愿意为我一个人买，所以您看能不能在没有G418的情况下筛选呢？
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发表于 2015-7-2 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，我的后面段基因是优化过了的．
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dmg[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这样长的片段在原核表达没有问题的，pET、pGEX系列的载体都是比较常用的原核表达载体，这两种载体都是融合表达，在目的蛋白上会多出一些氨基酸序列，但是比较好表达，不知道你表达后是想做什么用？
我想只有一段优化不会提高表达效果的。G418贵了点，但是现在好像便宜了。不筛高拷贝的，你只能多挑克隆，“海选”了。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-7-2 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做融合表达的目的是为了与单独表达时进行一些蛋白功能比较．
海选的意思是我需要挑很多克隆进行表达，看哪个的表达量更高吗？我们实
验室做酵母的都失败了，不知道我的结果会怎样．．．．．．
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