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标题:【求助】PCR延伸时间是不是和扩增片段大小有关?

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR延伸时间是不是和扩增片段大小有关?


我在文献上找到的我课题的pcr反应条件,延伸时间只有30-40秒,是在外文文献上找到的,这个时间是不是太短了?我不敢按这个条件跑pcr.
请高人指点,谢谢!
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是甲基化pcr!
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qhyu[使用道具]
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 小中大

我扩增的产物片段只要几十个bp,是不是产物小,延伸时间才不需要很长,别人做pcr,扩增时间一般都是几分钟啊!还是文献上的数据有问题啊?
急!!
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

普通的PCR只要根据酶的说明书来设定反应时间就可以了，一般TAQ酶每分钟延伸1KB，但甲基化PCR我不知道，希望你解释一下什么叫甲基化PCR？
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qhyu[使用道具]
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 小中大

甲基化pcr是在做pcr之前,将模板DNA做甲基化修饰,pcr反应及电泳步骤都是一样的!我在分子生物学书上看到:延伸时间与产物片段长度有关,产物在1kb以内的延伸时间为1分钟左右,3kb-4kb的需延伸3-4分钟.我的热启动taq酶说明书上举例的pcr反应条件是:94度30s,55度30s,72度1min,72度5min,前三个一起35个循环.
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不明白,说明书上,72度1min后,为什么还要72度5min?这是什么意思啊?
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qhyu 于 2015-7-2 22:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我不明白,说明书上,72度1min后,为什么还要72度5min?这是什么意思啊?

PCR反应的延伸反应通常为72度，接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75度，实际上，引物延伸在退火时即已开始，而Taq酶的作用范围是20－85度。延伸时间的长短取决于目的片段的长度和浓度，一般反应体系中，Taq聚合酶每分钟可合成2kbDNA，而据经验，靶基因每1kb延伸的时间为1分钟，延伸时间过长会导致产物的非特异性扩增，但对低浓度的目的序列，则可适当增加延伸时间。此外，由于DNA的二级结构、DNA碱基错配、反应体系的组分不当等原因，使Taq酶根据底物合成反义链往往不能一次完成，此时Taq酶从底物链上解脱下来，待反应条件合适时又开始扩增，以致会形成不完整的扩增链。所以，一般在扩增反应完成后需要最后一步较长时间（10－30分钟）的延伸，以补平扩增链、获得尽可能完整的产物。对于长片段的扩增，加长延伸时间很有必要，因为长片段扩增的过程中，形成不完整链扩增的机会较短片段扩增的机会似乎多些。该步骤对于后续的克隆和测序非常重要，如通常情况下，一般的Taq酶可以在PCR产物的末端加A尾，以利于TA克隆的进行。但是有实验表明，有些酶如高保真酶(pfu)则不加A尾。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主!
可是我查到的文献上没有末端延伸这一步,不知道是没写还是没做,昨天我扩增了一次,我自己设置了末端延伸72度5min,跑电泳时,除了maker有条带外,其他的都没有扩增出来.不知道是哪里出了问题?
我准备今天再修饰一次,再p一次,不知道pcr条件要不要改?
还望高手指点!
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qhyu 于 2015-7-2 22:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主!
可是我查到的文献上没有末端延伸这一步,不知道是没写还是没做,昨天我扩增了一次,我自己设置了末端延伸72度5min,跑电泳时,除了maker有条带外,其他的都没有扩增出来.不知道是哪里出了问题?
我准备今天再修饰 ...

您的具体PCR和电泳的条件（包括体系和参数）是什么样的，您列出的Taq酶的推荐反应条件是您所应用的吗？一般来讲，对于每一特定的PCR反应，体系和循环册书应该是各自特有的，譬如说引物的Tm值，PCR buffer中的离子强度等主要决定了退火温度的选择，目的片段的大小，主要决定了延伸时间等等，并不是所有的PCR反应都会按照商品化酶的通用条件来做，要想得到好的PCR条带，需要不断的优化PCR的反应体系，考虑到诸如GC等等的因素，况且您的电泳条件如何也影响着您的结果，因为片段为几十bp，需要高浓度（1.5－2.0％以上）的胶，且电影节的时间、距离和电压也很关键！请给出您具体的条件再分析！
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am10[使用道具]
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发表于 2015-7-2 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qhyu 于 2015-7-2 22:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我扩增的产物片段只要几十个bp,是不是产物小,延伸时间才不需要很长,别人做pcr,扩增时间一般都是几分钟啊!还是文献上的数据有问题啊?
急!!

片段小，延伸时间一定不能太长，不然，会有很多非特异的产物。
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