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标题:【求助】关于PCR退火时间和延伸时间关系得问题

西子[使用道具]
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发表于 2015-7-3 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于PCR退火时间和延伸时间关系得问题


请问各位老师：
为什么理论上退火时间要小于延伸时间，如果长了会有什么不好的后果呢？还有我得扩增片段长度是700bp左右，一般退火时间，延伸时间各是多少为好呢？
在此先谢谢大家了！
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西子[使用道具]
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发表于 2015-7-3 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
补充一下，听说退火时间经验值是30秒到45秒，如果对于300以上bp,我用一分钟的退火时间可以吗？
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发表于 2015-7-3 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先要说一下退火温度以及延伸温度
退火温度，大家可以去查一下，是摸板和引物配对的最佳温度，实际上这个最佳温度也只是保证在反应体系中有50%以上的摸板和引物正确配对
延伸温度，可以说是tag酶 让引物延伸的最佳温度
那么我这里在提个问题，在退火的时候是不是tag就不作用呢？在延伸的时候就不产生摸板和引物配对呢？显然答案是否定的，就是在退火的时候也会产生延伸最用，而在延伸的时候也会产生配对，只是效率相对较低而以
其次还要说一下，就是mg的作用，mg的作用是激活DNA和tag酶。
所以如果说退火时间过长，那么我们可以想象，酶会在低效率的情况下，长时间工作，对酶的活力有较大的影响，即使在72度最佳延伸温度延伸的时候也未必能得到最好的结果，所以一般延伸温度一般比退火温度时间长，就是这点原因，让酶可以激活，让酶可以保持高效率扩增效率
还有要提出一点，在反应体系中那么多东西，他不会那么老实，要知道pcr扩增只要有3‘端有3个碱基配对上，就可以得到扩增，如果时间退火过长，就有可能导致非特异扩增，或者产生引物错搭而导致非特异扩增。
而对于退火时间和延伸时间，只要靠经验积累
一般来说退火30s--1min就可以了，延伸也就30s-2min
对于最后一个问题，1分钟退火没有问题，呵呵
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