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标题:【讨论帖】动物细胞规模化培养

ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-7-9 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
高效表达载体与宿主细胞的关系密切，虽然楼主认为没有什么好说的，但是本人还是唠叨两句，主要是针对抗体生产的高效表达载体构建。

====================================================================================================

说得很好，我说没什么好说的主要原因在于，我的专长不在这方面，而且很大程度上，国内在这个领域的木桶短板，工艺方居首。
顺便也在这里总结一下规模化培养动物细胞的几个前提：
1）高效表达载体；
2）适合培养、高表达并相对稳定的细胞株；
3）优化的培养工艺（包括培养基、补料策略）；
4）与之工艺相应的设备。
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发表于 2015-7-9 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们公司的设备就是瑞士BIO的
1000L发酵罐
德国的罐是最好的
不是美国NBS
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发表于 2015-7-9 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Cell lines in production of antibody


据文献报道2005年通过美国FDA认证的18种治疗抗体中，有10种由CHO细胞生产，8种为鼠淋巴细胞（包括NSO和Sp2/0-Ag）生产。除此外，工业上杂交瘤细胞和人肿瘤细胞PER.C6也常常用来生产抗体。
1，一般生产抗体的CHO细胞不外乎基于两种系统：DHFR和GS系统。前者用到CHO细胞最普遍的是CHO DUKX-B11和DG44两种，后者基本上是CHO-K1或者CHOK1SV。两个系统各有优缺点：DHFR系统稳定株筛选的过程十分漫长，工作量巨大但能够筛选到Qp(单位细胞生产力）很高的稳定株（50～90pg/cell/day），GS系统由于不需要在培养基中加谷胺酰胺所以游离氨副产物很低，这一点对产物的正确糖基化和细胞生长都十分有利，而且筛选时间要比DHFR系统短一倍，但所能筛选到稳定株的基因拷贝数却可能比DHFR系统的低（4～10之间）。研究发现，当目的蛋白的天然糖基化模式和CHO细胞相同时，CHO翻译后修饰的效率很高;另外还发现，虽然动物细胞唾液酸结构和人有区别，鼠源细胞中N-glyculyl-neuraminic acid(NGNA)占绝大多数，但CHO表达的糖蛋白却有85％以上的为N-acetyl-neuraminic acid(NANA),和人体中的存在形式基本相同（NANA）。鼠源细胞的α1，3半乳糖苷转移酶会产生具有高免疫原性的Galα1,3-Galβ1,4-GlcNac,但非常幸运的是，这种酶在CHO（也包括BHK细胞）中几乎没有活性。当然CHO细胞和人源细胞表达的蛋白还有一些不同的地方，但是目前为止并没有发现这些不同会带来免疫原性问题。
to be continued...
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发表于 2015-7-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
和主流的观点相反，我个人认为中国在上游构建和细胞筛选上的水平很低，而这方面的提高更慢，相比之下，取得工艺上的进步更容易一些。
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发表于 2015-7-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yes4 于 2015-7-9 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
和主流的观点相反，我个人认为中国在上游构建和细胞筛选上的水平很低，而这方面的提高更慢，相比之下，取得工艺上的进步更容易一些。

我可能不同意你的观点,据我所知，动物细胞表达载体构建在国内并不新鲜了，具体的个案不在此列举，但你在CNKI上看看应该有所了解－－当然我这么说也并非说这方面已无改进可言。细胞筛选，相对来说主要体现在工作量上，即使是国外除了用机器人代替人工筛选外据我所知目前也并没有实质上有突破的办法（国内国外关于基因特异性的整合进染色体而获得高表达的案例都仅仅限于研究，是否具有商业价值还要进一步研究,至少目前在商业化生产中还没见到－－关于这方面的综述已经有了，并不象人们一开始想象的那么简单）。工艺的进步相对来说是一个更加系统的问题，而很多人在这方面过多的借鉴微生物培养的经验，实际上动物细胞（抑或昆虫细胞）的大规模培养要比微生物苛刻得多。某种意义上说，它不单单需要细胞生物学方面的支持，更需要有很强的工程方面的概念（这个恰恰是很多半道从生物学方面转过来的所极其缺乏的，也因此导致得出很多错误的概念－－这样的例子非常多）。工艺的意义也就在于需要整合各个单个的方面的进步，最终转化成生产力，而这个就目前国内的状况来说，从事的人不多，而能胜任的就更少之又少了。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-7-9 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

工艺上面较之于上游构建发展更困难，以个人观点还在于：
1）工艺研究方面的资料大多数存在于各个商业公司，只要不是公认成为成熟技术前，基本上不会发表。这一点和上游构建有很大差异，后者可以借鉴的的东西要多得多。
2）比较费钱，这是国内发展之所以慢的又一个原因。反应器的设计制造牵涉的基础产业要比上游构建多，而我们国家这样生物行业的基础部件制造商少且质量上不去（虽然技术上也许并没有克服不了的困难）。反过来说，这个行业也没有表现出来这方面的旺盛的需求。
3）基于2），人才培养跟不上，高校学生或研究生基本上得不到这样的实践机会，即使有人想做这方面的事情，也不一定马上能有这方面的合适人才，随之而来的培训将又是一笔成本。
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发表于 2015-7-9 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

介绍两种悬浮细胞生物反应器，一种适合制备克以下量单克隆抗体或毫克级重组蛋白，供研究实验室或中试用。另一种适合制备公斤级单抗或蛋白，供工业化生产用。
第一种是半透膜两室结构培养罐，细胞室可培养20-40毫升细胞，可用无血清培养基，活细胞常规可维持2X10E7/ml, 细胞总量5X10E8到10E9。单抗含量常规可达到200-900微克/ml。培养基室容量500-1000毫升。建立好的培养可连续维持一个月以上，只需定时换液和收获培养物。培养时需摇床。
第二种是中空纤维生物反应器，但整合了气体交换系统，并可对培养细胞感染病毒或转染外源性基因。
两种反应器正在申请中国发明专利。感兴趣者可跟帖讨论或和PM我
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发表于 2015-7-9 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚进入这个行业,用的是NBS的CELLIGEN PLUS 14L*6。我们这的单位产量还远低于你们说的数，我们也想改进工艺，但感觉哪都需要改进，有点不知从哪下手。更要命的是公司领导根本不支持我们，他们只注意眼前利益，宁愿使劲生产但不挣多少钱，也不愿花费点时间改进工艺......
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发表于 2015-7-9 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知cccDNA不周是否有空 整理个 细胞规模化培养 的摘要和数个关键词 出来，多谢多谢
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-7-9 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在大规模动物细胞培养工艺中,工程类相关知识是基础,在搞懂各相关零部件的原理和功能时才能更好的改进培养工艺 ,相信随着行业的发展,此领域的人才需求量增大,生物类专业的毕业生出路会有所改观.
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