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标题:我认为最好的在线引物设计软件 [转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-13 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物必须位于起始密码子与终止密码子之间，即CDS之间
楼主，您的意思是搜索目的基因时，要选择CDS限定的基因序列对吧，要是的话，我选了以后，把它考到您说的软件中，可总提示
ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range
我修改了好多次参数，可还是不行，希望楼主能给予指导，因万事具备，只欠引物，以下是我要设计的人的因子和目的基因
HIF-1a
1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa
61 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt
121 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg
181 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt
241 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt
301 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg
361 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac
421 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa
481 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga
541 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta
601 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg
661 gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag
721 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc
781 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat
841 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc
901 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa
961 gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac
1021 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc
1081 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca
1141 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg
1201 gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact
1261 gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac
1321 gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag
1381 ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca
1441 aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt
1501 ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt
1561 ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt
1621 gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag
1681 atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg
1741 tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca
1801 gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc
1861 actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca
1921 tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga
1981 gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca
2041 gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca
2101 gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga
2161 aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag
2221 ccagacgatc atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct
2281 agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt
2341 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt
2401 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga
2461 gctttggatc aagttaactg a
VEGF

1 ctgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg
61 cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc
121 ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc
181 tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg
241 agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag
301 aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg
361 ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc
421 cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc
481 cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc
541 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat
601 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg
661 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac
721 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg
781 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc
841 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg
901 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa
961 aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg
1021 tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac
1081 gaacgtactt gcagatctct caccaggaaa gactga

希望能得到楼主的回帖
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发表于 2011-8-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请楼主有空之余能阅读我的帖子


Primers for 1 (Entered)
These primers are for PCR
Forward-Primer ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGA Reverse-Primer TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAA
Length: 22 Length: 30
Percent GC: 81 Percent GC: 36
Tm: 80 Tm: 60
Self-Anneal: 32 Self-Anneal: 20
End-Anneal: 4 End-Anneal: 12
Offset: 1 Offset: 2481

Pair-Anneal: 14
Pair-End-Anneal: 6
Total valid primer pairs: 208

These primers will amplify a fragment of 2481 basepairs
The sequence of DNA that will be amplified by these primers is
1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa
61 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt
121 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg
181 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt
241 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt
301 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg
361 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac
421 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa
481 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga
541 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta
601 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg
661 gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag
721 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc
781 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat
841 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc
901 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa
961 gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac
1021 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc
1081 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca
1141 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg
1201 gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact
1261 gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac
1321 gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag
1381 ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca
1441 aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt
1501 ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt
1561 ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt
1621 gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag
1681 atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg
1741 tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca
1801 gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc
1861 actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca
1921 tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga
1981 gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca
2041 gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca
2101 gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga
2161 aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag
2221 ccagacgatc atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct
2281 agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt
2341 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt
2401 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga
2461 gctttggatc aagttaactg a
这是我检索出的引物序列，麻烦楼主在有空之闲帮我看看设计出的引物是否合适，万分感激！
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发表于 2011-8-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看上去并不是很合适，因为两端的GC含量差别太大，退火温度差别也很大。
不过这个软件总是给要求给我们最合适的情况，理论上不合适，不代表一定p不出来。
你可以试试，我也没有把握。
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发表于 2011-8-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，您好！
我看了您介绍的引物在线设计软件，的确好用，但是由于我要扩的部分GC含量相对较高，照您说的“在Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES这一项中，一定要选择yes”，我点YES时，总提示我GC含量范围不对，一次误操作没点YES，默然的NO，竟然出了很多引物，我想问：为什么一定要点YES？是不是点YES，设计出的引物扩出来的是我输入的整个序列长？请解答一下，谢谢您了 。
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发表于 2011-8-13 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
选yes，设计出来的是确切的引物片段，p出来之后的序列也是对的。
具体的，你可以阅读网站的介绍。
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发表于 2011-8-13 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
atataatttattccatatatatgggtagtccatatgcatatgggtatcttttgttattttttttatatggactagttgtacaatggtaataggtggctgaATGGAATATTCTATTGCTTATGGACTACTTTTACACCACATTGTGGATGCCCTGAGACATTTTTGCGACAGCAAACAGCATGTCATGTGTTTCCGGCAATTTTTCTTCTCTTGCAGGGAACATTCGACTCATTTTTACGGCTGCTTTCACATCGTCGAATCATTTGAAGGCAATCAGATAGTTGGGGTTTATATAGTTTTAGAGGGGGCACCTAGTCGGCGCGTGTGCGTCCCCGGTGCACGTTTTCCGGGACTAAAAGGGGATGCATCAACGATCTACGTTGTCAATACCCATATACATACATACGTTGGAACTTGCTGCTTGCATTATCGCATCAAGAACATCATATTGCAAAGTAGTACGCTGAGGCCGCGCACCACCACCGTACGCCGTCTCCGGCAAGGTTTGCTCTCGACAGTCTCTGCACGATCGCGGCTGCTGCTCGTCCGATCCAAGTACGGCAATTGCCGCGACCGATCAAACGAGCTAAACCGCTGCATTTGTGTAGGCCGTGGATCGGTGAAGGGCTGAcatgagccgtgatgcgtcggCAGGAGCCTCTACACGACATggtcgttcatctcgaattccctatgcatcccgttccagattgttacttataaccaaccatgcaccgagagacaacgtatatatgttctagttctacagttctactactgctgcatttccaacagaacagaggaaggggatggtttggttttccagttttctattttctgattctatacccagagttgtagcagcaacactagctagcttatttatatatatgggtacttggcgaggtactacctccatcctaaaatgttt
楼主：帮我设计这个序列的引物，我用你给的网址没有设计出来合适的。
感谢！！！！
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发表于 2011-8-13 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问您知道突变引物设计的一些原则和软件吗？
谢谢哦
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发表于 2011-8-13 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问版主,我刚用你介绍的软件设计了一下引物,得到了几对引物,但我想请教一下,你那方法是对PCR的,那realtime-PCR可以这样用吗,谢谢
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发表于 2011-8-13 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好！我的片断P很久了，都没有出来，估计就是属于那种极品，后来我按你的方法试了，但改了很多次参数都不行，楼主能否帮看看，要怎么改合适啊！万分感谢！
Get primers
Primers for PCR

There were 1 forward primers in the valid range for GC content.
There were 66 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 0 forward primers in the valid range for melting temperature.

ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range

我的片断是 GTTTATGTTAAAGATGATAAAATAAGATTGCTGGAAGAGCAACTACAACATGAAATTTCAAACAAAATGGAAGAATTTAAGATTCTAAATGACCAAAACAAAGCATTAAAATCAGAAGTTCAGAAGCTACAGACTCTTGTTTCTGAACAGCCTAATAAGGATGTTGTGGAACAAATGGAAAAATGCATTCAAGAAAAAGATGAGAAGTTAAAGACTGTGGAAGAATTACTTGAAACTGGACTTATTCAGGTGGCAACTAAAGAAGAGGAGCTGAATGCA
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发表于 2011-8-13 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想P一个很长序列的其中含snp的一部分，应该怎么选择目的片段呢？  
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