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标题:环介导等温扩增技术专题讨论 [转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-13 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
heliX酶哪里可以购买？
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发表于 2011-8-13 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下大家：
我去试过官方网站上的引物设计软件，但是怎么都用不了，是否需要进行一些设置呢？“activate Java and Javascript”，网站原话，什么意思？。
哪位用过的能否指点一下？
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发表于 2011-8-13 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好：
我有一个问题想请教一下：
你们最后检测时用过 SYBR GREEN I 吗？它的终浓度是多少？有直接加到体系里的吗？像实时定量PCR那样.

有兴趣的同行也可以加QQ联系：32371003
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发表于 2011-8-13 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家有没有遇到过引物失活的问题？
好像保存2、3个月后扩增效果就会慢慢减弱。是否是因为引物片段过长比较难以保存所致？
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发表于 2011-8-13 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做灵敏度实验，从十的负五次方稀释到十的负十次方，结果只有十的负八次方和没加模板的阴性对照跑出来了。我的操作是在超净台中进行，带手套，也很注意防污染。这两个能跑出来的条带的带型一样，是特征性带。
具体操作是分装7管，前边6管加稀释好的模板，最后一管我偷懒，连2ulDEPC水阴性模板都没加。但出现带。怎么会出来！污染的话，前边加模板的5管怎么又没出来？！
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发表于 2011-8-13 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一下，我把体系中的各种试剂先加在一个指行管里，再用200UL枪头调50UL吹打50次，是绝对混匀后分装的。
稀释的RNA没扔掉，在做完LAMP 后我用普通RT-PCR检测。引物是我以前做普通PCR检测时设计的引物，和LAMP无关。结果十的负三到十的负五都有特异性带。LAMP加模板是绝对加进去的。我很仔细的观察过枪头，确认无误后再加入分装后的前6个PCR管。是没有任何问题的。
现在的问题是LAMP前3管应该跑出来的，但结果就是没有。阴性对照应该没却是有！
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发表于 2011-8-13 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果有前边所说那么容易污染的话，我放弃了。因为这么容易污染，根本没有任何应用前景。还能指望能做检测么。灵敏度虽重要，但正确率更重要。它设计的初衷就是给条件简陋的环境使用的。开下PCR管盖，空气就污染了，以后都假阳性了，那还有毛用啊。现在根本没条件不开盖检测。就看那个什么白色反应产物，是很难区别有没有反应的，在我的实验中，即使你扩的产物很多，管壁也不一定很白。
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发表于 2011-8-13 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我很理解您的心情，我也深有同感。我的实验现在阳性污染的问题就一直没有解决，东西都换了，加样也跑到别的实验室了，枪也用的别的实验室的，但是还是会出现阴性跑出阳性条带，要是这样的话特异性，灵敏性根本没法进行。
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 小中大
我之前灵敏度也做过一次。模板从十的负5到十的负7，条带却越来越亮，负8无，负9又出现，但比负5弱，负9是能扩出的四条带中最弱的。我们实验室的成像系统是BIO-RAD，文件格式为1SC 文件。不能转换，上传也不支持。请各位高手指教，我感激不尽。
有条件的话请大家M我,我把图片传给您分析。QQ 331589418
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 小中大
只要读懂原理，就自然明白最小条带比外引物的小了的原因。
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