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标题:环介导等温扩增技术专题讨论 [转自 丁香园论坛]

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Betaine 可以设计为0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0.
另外模板浓度作稀释,确实有不少报道也许10-5能跑出来,但是10-4就跑不出来的。试试看吧~~
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您好,我做LAMP时,一开始我是按照创立这项技术的那个人所给的体系和条件做的,没做出来,摸了很多条件,也都没做出来(dNTP浓度我从0.4-1.4mM,镁离子6mM和8mM,引物从1:4-10(外引物0.2没变,内引物从0.8-2),甜菜碱1M)。我验证了一下引物,用普通PCR分别以B3和F3为上下游引物,FIP和BIP为上下游引物,均扩增出预期大小的片段,证明引物没问题,但就是LAMP扩不出梯状条带,我很是困惑,希望您给解答一下。
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LAMP针对靶序列上6个区段,设计四条特异性引物,利用具有链置换活性的聚合酶,在65℃左右对核酸进行扩增。短时间(0.5~1h)扩增效率可达到10e9个拷贝。LAMP反应中,产生副产物焦磷酸镁乳白色沉淀,利用浊度仪可定量检测,或结合荧光染料实现或定量或肉眼判读结果。不需要PCR仪和检测仪器,仅水浴锅即能完成反应。

滚环DNA 扩增(RCA) 是一种等温信号扩增方法,既可进行靶核酸扩增,也可进行信号放大扩增。RCA有线性与指数两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后,在DNA聚合酶作用下被延伸,产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体,线性扩增倍数为10e5。指数RCA原理与线性RCA相同,采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物,该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸,其产物又作为第一种探针的模板,这样一来在很短的时间内(1h),产物呈指数递增。指数RCA可用于非环状DNA的扩增,设计一引物,其两端可结合到一段连续的序列上,并形成缺口,在连接酶作用下,引物被连接成环状。此环状引物可作为RCA的模板,进行指数扩增。指数扩增倍数能达10e7。RCA 是一种适合在芯片上进行信号扩增的技术,它既能提供研究分析的敏感性和特异性,又能保持立体分析的多元性。RCA 亦是一种痕量的分子检测方法,可用于极其微量的生物大分子和生物标志的检测与研究,也可用于突变与SNP的检测。

解链酶扩增技术(HDA)则是解旋酶解开双链DNA,单链DNA结合蛋白与单链结合,使模板处于单链状态并保护其完整性,引物与模板结合,然后在DNA 聚合酶作用下扩增。生成的dsDNA作为底物进入下一轮扩增。恒温扩增温度取决于所用的酶,可以60~65℃,也可以是37℃。
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体系和模板都没问题的情况下,就是引物问题
模板验证可以用其他方法验证
体系的话如果你检测其他东西能行,体系就ok
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请教各位LAMP酶切位点如何选择,片段大小如何计算谢谢各位了!  
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你好,老板让我做一种病原物的检测,我想采用LAMP,但是实验室里的师兄师姐对这个都不知道,老板的分子生物学水平也有限而且很忙,我有这个想法,但不知道从何下手。从理论上看这个方法是行得通的,但是如果出现什么假阳性,以及目的基因扩不出来,老板一定会很不高兴,她对我们的要求是不能浪费钱。我现在多郁闷,可不可以帮帮我啊,真的非常感谢!
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如何用LAMP检测单核苷酸多态性啊,最近一直迷惑,但确实看到可以检测,但不知道原理。
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我设了一组LAMP引物,最先可以扩到很好的目的带,后来总是阴性对照被扩成阳性,就停了一段时间没做,过年来了以后就怎样都无法扩到目的带。引物换用了新和成的,其他试剂全换过了,还是没有办法扩到任何条带,仅有很亮的引物二聚体,有时候连二聚体都没有,请问各位有谁知道是为什么,请指教,先谢了!
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