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标题:RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自 丁香园论坛]

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fermentas(MBI)的逆转录试剂盒(RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit)这个我也用过,感觉还可以。  
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我现在正在做RT-PCR,引物退火温度我已经摸好,能P出比较亮的条带,当时是用的33个循环摸的,请问平台期前的最佳循环数是不是也必须要摸啊?
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马上要做了,谢谢分享!
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学习了,我也刚做RT-PCR
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我居然和楼主用的是同一家公司的逆转录试剂盒。我也才开始做RT-PCR,我觉得我在逆转录环节应该没问题,问题应该出现在引物或者是PCR体系里
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我用的也是fermentas的!要扩3000bp的目的基因片段,用的是加好MgCl2的buffer,酶用的也是该公司的长片段扩增的taq酶,每次用推荐的体系配方以10微升体系pcr,做10个温度梯度,但做了6.7次了还是没有目的条带出来,只能看到引物二聚体,着急啊!
已经跑了内参,证明模板没有问题,不知楼主可能指点一二,看看哪些地方还需调整  
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另外我的引物是上海生工合成的 ,在冰箱里冻了快1年才拿出来用,因为是我师姐还在做实验的时候合成的,不知道这么长时间可有什么问题
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我的PCR是六个样品两个跑出目的条带,其余四个没有,应该不是引物的问题吧?
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我想请教一下,RT的体系可以扩大到40uL么,效果会怎么样?谢谢。
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我现在就正在吊死在一个一个引物上
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