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标题:RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-20 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们在用康为的MIX，觉得还好，请问各位做RT－PCR一般把循环次数调到多少？
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发表于 2011-8-20 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
学习了，我们都是用TAKALA 和promega的，还没有用过MBI的
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发表于 2011-8-20 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢！我马上就做了，谢谢分享。  
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发表于 2011-8-20 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也开始要做白细胞因子的RTPCR，就是发现引物设计要包含能扩增特定区段有疑问，还有退火稳定怎么摸最合理，还有循环次数怎么掌握呢，新手，请各位不吝指教，谢谢
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发表于 2011-8-20 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是用Primer 3 或者文献的引物，P后没有条带
RT-PCR则最容易在以下环节出问题
1.RNA的质量
2.cDNA的质量（主要是试剂盒的问题)
3.PCR反应体系（酶，mg离子，模版量，）
4.PCR程序设定（最主要是变性和退火的温度、时间）
5.目的片段高GC的话（70%以上），要优化反应体系和PCR程序（降落PCR等）
6.其他还没想到
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 小中大
我想请问一下，我用的是Fermentas的PCR试剂盒，25ul体系的，mix加了12.5ul，上下游引物各加1微升，cDNA浓度1024ul/l，加了0.9ul。解链温度是95°C，5分钟。为什么没有目的条带出现呢？另外，我的管家基因有条带。会不会是引物有问题？引物是从影响因子较高的文献上找的。
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发表于 2011-8-20 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑了两次梯度，昨天几乎全都有条带（内参跟目的都有），今天却全没有条带（只有内参），最可能的问题是什么啊？为这实验很崩溃啊！
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发表于 2011-8-20 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
正准备做实验，学习了！谢谢
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 小中大
最近要做RT-PCR，刚接触这个技术，在文献里找不到引物，看来需要自己设计了，不知道引物设计具体需要要注意哪些细节啊，请楼主或其他大侠们指点指点，少走点弯路，多谢了！
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 小中大
新手在纠结中。。努力学习之。。。  
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