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标题:求助：限制酶SexAI的 保护碱基和定向克隆问题

果冻也酸[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1 and 2. 只要比你目的序列长一些，而且跑胶结果很明显能看出，PCR结果比目的片段还要长就行。

3. 连接产物转化感受态，长出的单菌落只含有一种重组质粒。如果你得到鉴定正确的结果了，就提取正确的质粒就可以了。后面你想怎么做都可以了。

不知道你看明白了么？
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发表于 2011-8-23 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恩。大体思路都清楚了。只是还没有做过心理有点虚。另外还有：

1：新的上游序列到底比插入位点多出多少bp比较合适呢？因为我克隆的基因本来就比较长（近3kb），200-300bp怎么样啊？200多bp的差距在电泳图片上是不是有点小了，太大的话又会不会影响pcr扩增，不易扩增？

2：用来鉴定方向的新上游引物是不是就不需要加酶切位点和保护碱基了？

谢谢您的回答。
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发表于 2011-8-23 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，我在设计引物的时候，下游引物模板GC含量很低（<20%），这样设计出来的上下游引物Tm值相差较大（5摄氏度多），要想让Tm值接近，上下游引物的长度要差6、7个bp，而引物设计原则中建议上下游引物长度不要相差4bp，我想这样关系不大吧。同时，要克隆表达一个基因，设计下游引物的时候必须包括终止密码子TAA么？还是可以从TAA开始向5'方向设计，或者从TAA下游3'开始向5‘方向设计下游引物，只要把TAA包括进去就可以了，又或者只要是TAA下游3’方向任意一段设计，哪怕不到，即不包括TAA，只要不让基因短了就Ok。
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发表于 2011-8-23 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 你的目的片段是3Kb，那么100-200bp的差距就没什么意思了。这样吧，你重新设计一对引物，上游引物在目的片段起始密码子ATG上游200bp，下游引物在起始密码子ATG之后200bp。这样的话，只要重组质粒PCR的结果在400bp左右有带，就说明连接正确了。而且这样PCR的时间会很短。

2. 用于鉴定的PCR引物不需要加酶切位点和保护性碱基。

3. 原则重要，但是要联系到自己的客观实际，如果上下游相差6-7bp能扩增出目的片段，何乐而不为呢？

4. 关于终止密码子的问题。不知道你是想进行原核表达还是真核表达呢，这里需要明确一下，因为二者有一点点不同。
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发表于 2011-8-23 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你想进行何种表达，细节详细一些
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发表于 2011-8-23 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要做的是进行原核表达。对于下游引物的设计在TAA上我还是比较混乱。因为我克隆后还要表达。请您在这里稍微说详细一点。另外，我在设计引物的时候，对怎么会造成移码突变而影响后续表达方面还是理解得比较混乱，也请你解释一下。再次感谢你的回答。
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发表于 2011-8-23 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果下游引物必须从TAA开始，那么怎么解决GC含量低的问题？只要Tm值合理就可以了么，哪怕GC含量很低？引物上下游差6、7个bpTm值是接近了，但下游引物的GC含量还是很低。
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