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标题:求助：荧光定量pcr的结果分析 [转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-23 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：荧光定量pcr的结果分析 [转自 丁香园论坛]

求助：荧光定量pcr的结果分析 [转自 丁香园论坛]


近期做荧光pcr，机器型号：ABI7000

设计：
①实验组cDNA+目的基因引物②实验组cDNA+管家基因actin

③对照组cDNA+目的基因引物④对照组cDNA+管家基因actin
3孔重复

反应体系25ul：sybr green 1 12.5ul
引物 0.5ul 【浓度10um/ul】
50*rox 0.5ul
cDNA 1.5ul 【20ul体系一步法合成cDNA，然后稀释5倍，取1.5ul】
灭菌三蒸水 10ul
循环温度，时间及次数： 95°c 1：00
95°c 00：15
60°c 1：00 40cycle


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 小中大
目的基因及管家基因：扩增曲线


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 小中大
管家基因-融解曲线


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发表于 2011-8-23 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因-融解曲线


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发表于 2011-8-23 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从你给的图上初步可以看出，cDNA模板可能有些低，所以出现的Ct比较大，你的目的基因表达的3个平行孔只有2个扩增曲线，有可能是加样误差或其他原因造成。从溶解曲线上看，内参的引物还可以，目的基因溶解曲线的2个峰有可能是gDNA的污染，或者其他污染及非特异性扩增。
建议：
提取RNA时候最好用DNase I消化去除gDNA。
cDNA可以不稀释作为模板。
再试试，看能不能解决。
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发表于 2011-8-23 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢战友的解答
我在提rna的时候确实没有用DNAase。

因为是刚进实验室没多久，首次操作，pcr仪器也是借用别个实验室的，当时赶时间，估计有个孔搞错了。
继续改进ing
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小蜜蜂[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
优化条件吧，首先加大模板浓度，降低退火温度开始吧  
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小蜜蜂[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
优化条件吧，首先加大模板浓度，降低退火温度开始吧  
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