PCR仪

3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGO DT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGO DT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGO DT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。

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请问
1：怎样看出一个基因的内含子，针对mRNA设计引物是不是就没有内含子？
2：TAKARA的逆转录酶逆转时间才15min，我做过一次结果还可以，请问有没有别的战友用过，还有他们protoc上没有72度变性的步骤，迷惑中......

Delta Delta Ct法根据公式推导——
终产物=初产物*2^N(cycle).

那个Ct值表示什么呀？

Ct值是表示达到你设定荧光所需的PCR循环数，建议多看点资料。

你好
双DELT法是相对定量表示GENE表达量的一种方法，与之对应的有绝对定量。

1：怎样看出一个基因的内含子，针对mRNA设计引物是不是就没有内含子？
2：TAKARA的逆转录酶逆转时间才15min，我做过一次结果还可以，请问有没有别的战友用过，还有他们protoc上没有72度变性的步骤，迷惑中

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1：一个基因的内含子和外显子在PUBMED上有详细的说明，对你的mRNA有详细的说明，如从203-450是外显子而从451-540是内含子，你可以看看。针对MRNA的引物设计要跨内含子设计，可以避免一些基因组的污染，所以养成一个习惯如果是批mRNA，则跨内含子。
2：我不太明白你的72度变性是什么意思，逆转录酶和TAQ酶的最佳作用温度不一样。

非常
有用的东西！

我个人认为应该做模版cDNA和水的MIX，这样可以消除cDNA的差异；因为我们的目的就是检测cDNA的不同；而引物浓度是有一个范围的，各管之间引物浓度的差异影响比cDNA的差异要小的多得多。