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标题:Real time PCR经验 从RNA的提取到PCR

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要做这个，谢谢LZ的分享，好经验啊
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于引物设计：个人认为需要协调好内参基因和待测基因的扩增片段大小、引物的Tm、GC分布等，其次引物的级别必须要高，用HPLC级别的较好；最后就是要通过PCR来确定引物是否合适；其次还可以用相同的模板进行梯度稀释，来调整条件使他们的扩增效率达到一致（要满足Delta Delta CT法需要两者的扩增效率小于0.1）。

关于设计引物跨内含子的问题，我觉得如果引物跨越内含子那是最好不过，但是一般情况下，我们只是局限于知道部分基因的cDNA序列，对于DNA序列是不知道的，所以设计引物时跨越内含子与否只有运气一说；不过检验倒是可以通过同时以DNA和cDNA为模板PCR扩增来看产物的带大小就可以了，不过如果内含子序列很大的话，你可能根本就不会从DNA模板中扩出条带，所以一定要有准备啊！

对于DNA污染的取出我们还是有办法的，就是用DNaseI充分的消化DNA。
以上我的观点难免会有不足，期待大家的指正，非常感谢！

Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method这片文章详细的介绍了Delta Delta CT法的数学模型与应用，相信对于想采用比较定量法分析基因表达的朋友是非常有用的哦！
需要文章的可以发邮件给我。

祝大家实验顺利！
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夕阳[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢分享！辛苦了！  
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年轮[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好
做目的基因和看家基因的扩增效率试验，严格要求是应该做两个基因的标准曲线，但是由于标准曲线的制备比较困难（纯度高的基因比较难获得）。所以很多人看两个基因的扩增曲线，如果两者在指数期的曲线平行，我们可以认为两者的扩增效率相同，但是条件比较好的实验室还是应该做标准曲线。

=======================================================

您好，继续提问：
１．＂如果两者在指数期的曲线平行＂怎么理解？你看我做的以下这张图（图一）能说是指数期平行吗？图一和图二其实是一样的实验设计的不同重复，而且图一是刚刚做Ｒeal Time时的结果，而图二是钻研重复了Ｎ多次的结果，为何结果相差这么大，且越做越不如以前了？能做表达差异的相对定量分析吗？

２做完标准曲线，如何判断扩增效率是否相同？是看斜率吗？
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好
我认为你的结果已经做的挺好的了，指数期可以认为是平行的，如果实验室条件有限的话可以计算结果了。
但是如果实验室条件比较好的话，最好还是做标准曲线，标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间是可信的。是指斜率。
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发表于 2011-8-23 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好
RNA的变性是指在70度的时候有些RNA的结构，如二聚体等可以打开，有利于反转录酶进行反转录，我觉得这样做更保险一些，就象有的人跑MRNA胶的时候习惯先变性下，让RNA成为单链，这样跑出来的条带漂亮些，一个道理。
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红豆冰[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢,我做RT-PCR,怎么有时候能批出来,有时候又批不出来呢,跟RT试剂盒有关吗?  
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢,我做RT-PCR,怎么有时候能批出来,有时候又批不出来呢,跟RT试剂盒有关吗?

====================================================================

批不出来有很多因素，既然你有时候能够批出来，证明你的试剂盒应该没有问题，你应该找其他的一些因素，你的问题说的不太详细。
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嘉年华[使用道具]
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 小中大
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-8-23 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好
我认为你的结果已经做的挺好的了，指数期可以认为是平行的，如果实验室条件有限的话可以计算结果了。
但是如果实验室条件比较好的话，最好还是做标准曲线，标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间是可信的。是指斜率。

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你好,
1.到底如何判断是否平行啊?我怎么感觉有交叉啊? 你觉得图片1和图片2哪个结果更好? 这两个结果差别原因可能是什么? 从扩增曲线能看出扩增效率吗?为什么你说可以计算结果了?你看出扩增效率一致了吗?请告诉我你的判断方法好吗?
2.标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间就可认为扩增效率一致,对吗?
3.做标准曲线必须用很纯的DNA做吗?我用逆转录后的cDNA可以做吗?或者用PCR后的产物做标准曲线可以吗?

谢谢!!
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