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标题:荧光定量PCR详细流程和问题解析

夕阳[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，呵呵  
~~~~~~~~~~
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小米虫子[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先收一下 最近在做real-time 有空来交流
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
横空出世高人一枚,汇总得很好,学习了

Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。
个人以前并没听过这个说法.楼主可否将这个问题阐述一下?

还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......
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发表于 2011-8-24 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好贴
谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？

在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？



RT-PCR的主要问题是RNA样品中存在gDNA污染。这样会引起假阳性的发生、特异性降低，或者特定RNA含量测量值偏高。
为了排除gDNA的污染对实验结果的影响，可以在特定的位置设计引物。
如下图：
1、在外显子与外显子连接处设计一条引物，另一条在外显子处。这样gDNA不会被扩增，而mRNA/cDNA可以扩增。
2、设计跨外显子、内含子的引物（一条或一对）。这样，mRNA/cDNA不会被扩增，而gDNA可以扩增。
3、在内含子两侧的外显子设计引物。gDNA扩增得到大扩增产物，mRNA/cDNA扩增得到小扩增产物。然后通过电泳等方法区别。
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发表于 2011-8-24 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常受用~ ~~~~~~
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发表于 2011-8-24 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
横空出世高人一枚,汇总得很好,学习了

Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。
个人以前并没听过这个说法.楼主可否将这个问题阐述一下?

还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......

===============================================================================================================

第一个问题：我个人的理解是，荧光定量是退火、延伸、荧光信号收集一步完成，如果扩增片段太长，势必影响荧光采集效率，如果有其它解释大家可以共同讨论。

第二个问题：这种说法不太合适，主要的意思是，为了确定合适引物浓度，可以采用过量的模板。
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发表于 2011-8-24 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常受用~
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章鱼小丸子[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......

也可以这样理解，在做多通道荧光定量试验优化时，需要考虑的是降低各个通道之间的相互干扰。
而最容易遇到的相互干扰是一个通道a对应的靶基因浓度很高，另外的通道b/c对应的基因浓度很低，那么a会先耗费大量的dNTP同时产生大量的焦磷酸和dNMP等PCR副产物，这些过早产生（比如在前15个cycle就有大量积累）的副产物会抑制其他通道b/c的反应。 b/c通道他们原来会在25cycle起跳，但由于dNTP的缺乏和抑制物的大量存在而无法起跳或很晚起跳。

为了解决这个问题就可以适当降低a通道对应基因的引物浓度，在不影响a通道的起跳的前提下抑制a通道消耗dNTP也抑制副产物的过量生成，从而不影响其他通道的检测。

这个问题我是没遇到过，听roche的人讲课我这样理解下来的。不过做taqman snp时感觉说的好像没错，但没自己真正验证过多通道pcr，感觉做科研的人患不着惹这个麻烦事。

关于Taqman法的扩增片段大小问题，如果考虑到taqman 的PCR循环参数是95度60度反复循环的话，片段还是短点的好，当然也不能短到引物探针都放不下。
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
挺好的主题，记下  
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冷太阳[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
荧光定量与常规定性pcr各有千秋，因试验而定，但荧光定量是一个发展方向
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