小中大那么基因表达差异应该计算为
基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这是公式的推导过程是根据PCR的基本原理而来的。PCR每次循环的产物量的积累过程应该是以2的倍数进行增长，即下一次循环是上一次循环产物量的2倍。如果正常样本的起始模板数是X，待测样本的起始模板数是Y，那么当两个样本都达到域值时，它们的产物量应该是一样的，如果这个时候两个样本的Ct值分别为Ct1和Ct2，则有：
X×2Ct1=Y×2Ct2
待测样本和对照样本起始模板数之比应为：
Y/X=2 Ct1/2 Ct2=2△Ct1
同理待测样品和对照样品中看家基因的起始模板的比就应该是：
Y’/X’=2 Ct1/2 Ct2=2△Ct2
这样经过看家基因纠正的基因表达差异应该是：
基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这个公式的前提是看家基因和目的基因的扩增效率相同并且都为100%，因为只有这个时候产物的增长速度才有2倍的关系，否则就要引入目的基因和看家基因的扩增效率E1和E2来修正这个公式。
5、标准品如何准备？
从理论上说基因表达分析实验是不需要标准品的，因为无需精确定出研究的组织或细胞中的某种基因的真实拷贝数，感兴趣的只是目标实验组和对照组的某种基因表达量的比值，也就是说想要得到的只是一个相对的数值和真实的拷贝数没有直接的关系。
那么在一些实验中为什么还要做标准曲线呢？这是为了纠正扩增效率不同的问题。从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，尤其在不同的基因的扩增中间。因为基因表达分析实验用到了目的基因和看家基因两种基因，这样这两种基因的扩增效率会有所不同。那么如果用看家基因来校正目的基因就会带来误差，刚才的公式也就不再适用了。这样考虑到看家基因和目的基因不同的扩增效率，就需要做标准曲线来精确反应样品管中基因的相对含量。
基因表达分析标准品的准备相对比较简单，因为要知道的都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数是一样的，比如前面是10倍稀释，后面赋值也是10倍变化。
最后的实验结果可以得到样品的拷贝数，再通过拷贝数来分析不同样品中基因表达的倍数差异。
需不需要作标准曲线要根据实验的具体情况来定，假如通过实验的验证，发现目的基因和看家基因的扩增效率基本一致并都接近1，并且对实验的精度要求不高的情况下就可以不用做标准曲线，直接通过公式来计算基因的表达差异。但是如果研究的样本本身的基因表达差异就不大，如果进行忽略就可能造成较大误差，这样就需要做标准曲线来纠正这种误差了，作到较为精确的定量。
