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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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三、 延伸温度与时间
延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近以获得最大的扩增效率。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视待扩增DNA片段的长度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35~100个核苷酸/秒，故延伸1min对于2kb的扩增片段已经足够，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。
四、 循环次数
循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现；循环数太少会影响正常的PCR产物量。
第四节 PCR反应条件的优化
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。本节将讨论如何根据预期的指标优化PCR反应体系的各参数以及如何评价PCR反应的忠实性。
一、 PCR反应条件的选择
(一) PCR反应体系成分
1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，但是必须预先纯化以除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102~105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1µg人基因组DNA、10g酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。
以质粒DNA和以染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者在PCR反应中所需要的酶量少，循环数少，温度也不如染色体DNA要求严格。
扩增靶序列的长度根据不同的目的而不同。例如，用于检测目的基因的扩增片断长度一般在500bp以内，一般100~300bp为最佳，然而，在适当的条件下，例如使用较长的延伸时间，可扩增长达10~20kb的片段。
2. 引物：PCR反应所需的引物质量要高，且需纯化，否则引物中相当数量的“错误序列”将导致非特异性扩增和信号强度降低。 通常引物设计应与模板精确互补，然而少数情况下在另外一些扩增中，如等位基因PCR、突变工程或在基因组的特定区引入新的限制性内切酶核酸酶切位点以及序列不清楚地同源基因的克隆，需要有目的的或是不可避免的引入错配碱基。由于引物与模板的结合不可能是完全特异性的，为了减少引物与模板的非特异性结合、提高PCR的特异性，引物序列应该从基因的内含子区域选择。引物的设计要遵循一定的原则，具体可参见第二节。PCR反应体系中引物的浓度一般为0.1~0.5µmol/L，在此范围内，PCR的产物量基本相同。若引物量过低会导致PCR产物量降低，而如果引物量过高，则会引起碱基错配和非特异性的扩增、生成引物二聚体，从而使目的DNA片段的扩增量下降。通常引物应当10倍量于靶序列。此外，引物的Tm值与退火温度相关，故引物的Tm最好在55℃~80℃的范围，以接近72℃为最佳。
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3. 反应缓冲系统：目前最为常用的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液。通常在缓冲液中加入50mmol/L以内的KCl以利于引物的退火，高于此浓度的KCl或NaCl会抑制Taq pol的活性，在有些缓冲系统中可以用16.6mmol/L的NH4+代替K+。此外还可向反应体系中加入小牛血清白蛋白(100µg/L)或明胶(0.01%)或Tween-20(0.05~0.1%)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等以保护Taq pol。尽管上述缓冲液适用于大多数的模板和寡核苷酸引物，但对于特定PCR的最佳缓冲条件还是随着模板、引物及反应液中其他成分的不同而不同。因此这里所谓的标准缓冲条件只能作为探索进一步的改进PCR反应体系的基础。
4. 二价阳离子(Mg2+)：耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。已经表明，对于提高耐热DNA聚合酶的活性，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+则无效。研究表明，若反应体系中Mg2+浓度过低会显著降低酶的活性，而Mg2+浓度过高时又使酶催化非特异性扩增增强。此外Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度，从而影响扩增片段的产率。由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低反应体系中的游离Mg2+的浓度，而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，因此一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同，因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中的Mg2+的最适浓度。例如，虽然通常使用的Mg2+浓度为1.5mmol/L，然而也有报道使用高达4.5 mmol/L或6 mmol/L的Mg2+以降低某些情况下的非特异性的扩增。现在很多公司(例如Invitrogen、Peikin-Elmer和Stratagence)出售缓冲系统优化工具包，这些工具包含有各种各样的缓冲系统组合以方便实验者能迅速的找出对于特定的模板核酸和引物组合的最佳缓冲系统。此外我们还可以用下面的方法优化Mg2+浓度。在确定模板DNA的量、引物、dNTP的浓度以及PCR的循环参数的前提下，从10mmol/L的Mg2+储存液中，将Mg2+的加入量以0.5mmol/L递增，逐一加入10支反应管中，即每支反应管中的Mg2+浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L。根据比较这10支含有不同浓度的Mg2+的反应管的PCR产物的产量，来确定反应体系所需的Mg2+浓度。有时，还可在此基础上，在初步选定的Mg2+浓度范围上下进一步缩小Mg2+浓度范围以0.2mmol/L递增，进一步筛选以获得最佳Mg2+浓度。
5. 三磷酸脱氧核苷酸：PCR反应体系中的四种dNTP的浓度应当相等，以使错误掺入率降至最低。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应尤为重要。dNTP的浓度过高可加快反应速度，同时也增加了碱基错配率和实验成本；降低浓度可导致反应速度下降，但可提高反应的特异性。通常的PCR反应体系中，dNTP的浓度应在20~200µmol/L之间，在此范围内，PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。如在100µl反应液中，当每种dNTP的浓度为20µmol/L时，理论上可以扩增出2.6µg的400bp的DNA。有报道，应用每种浓度低至2µmol/L的dNTP可以成功的检出107拷贝的DNA分子中的一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规的PCR反应中应当避免，因为保持四种dNTP的浓度在其Km值(10~15µmol/L)以上，对保持碱基掺入的忠实性是极为重要的。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq pol的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响DNA pol的活性。
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6. 耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶在PCR反应中起着关键的作用，因此PCR反应体系中耐热DNA聚合酶的选择及其用量显得尤为重要。目前用于PCR的耐热DNA聚合酶已有多种，其中最常用的仍然是Taq DNA聚合酶。下面讨论的情况将以美国PE-Cetus公司生产的Taq DNA聚合酶为依据。Taq pol的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感。Taq pol是Mg2+依赖性酶因而对Mg2+的浓度最为敏感。以蛙鱼精DNA为模板，dNTP的总浓度在0.7~0.8mmol/L，使用不同浓度的Mg2+进行反应10min，结果表明，Mg2+浓度在2.0mmol/L时酶的活性最高，若Mg2+浓度偏高时，则酶的活性将受到抑制。需要注意的是由于PCR反应体系中的模板DNA、引物以及dNTP均可与Mg2+结合，因此Mg2+浓度在不同反应体系中应适当调整。K+的最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。50mmol/L的NH4Cl对Taq pol的活性中等抑制。50mmol/L的NaCl可以提高Taq pol的活性20%~30%。由于Taq pol没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各20µmol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq pol的错配率约为0.25%)。Taq pol在PCR反应体系中的加入量也很重要，若酶量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增。在其它参数最佳的时候，每100µl反应液中加入1~2.5U的Taq pol为最佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。此外不同的变性剂对Taq pol的影响不同(如表1-1)，由于有时需要向PCR反应体系中加入一定浓度的DMSO、甲酰胺等作为PCR反应促进剂，以改善反应的扩增效率及特异性，因此，当PCR反应体系中存在Taq pol的抑制剂时，应适当的调整Taq pol的用量。另外不同厂家生产的酶的性能及质量也有所不同，因此在实际情况下应当根据PCR反应体系中特定的模板分子和引物、反应体系中的Taq pol抑制剂对不同厂家生产的不同批次的Taq pol进行优化。通常在100µl的反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验酶的最佳浓度。
目前，Taq pol仍然是常规扩增小片段DNA首选的耐热DNA聚合酶。然而在其它一些特殊情况下(例如当要求较高的PCR反应忠实性时，当待增模板DNA的长度超过数千碱基对时，或当使用RT-PCR技术克隆mRNA时)，其它耐热DNA聚合酶与Taq pol相比具有显著的优点。因此，我们应当根据具体实验的目的来选择特定的耐热DNA聚合酶。例如，当实验的目标是获取一个目的基因的真实拷贝时，就需要选择具有校正阅读功能的聚合酶；然而当实验的目标是克隆一个扩增产物时，能够产生平端切口的聚合酶也许是最佳的选择。然而，当两种或者更多的DNA聚合酶混合在一起使用时能够显著的提高PCR反应的扩增产量，尤其当反应模板核酸为长链DNA时更为明显。这可能是由于各种聚合酶功能上的互补作用使其能够更加容易的使引物延长链顺利地通过模板链上的各种潜在的障碍(包括模板链上的高度二级结构、缺乏末端转移酶活性的聚合酶无法连接的模板链缺口以及使无校正阅读活性的聚合酶停滞并与引物模板杂交链脱离的错配碱基对)。现在许多厂商出售混合配方的耐热DNA聚合酶，以获得在特定的反表(1-1) 变性剂对Taq pol活性的影响
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发表于 2011-8-24 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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变性剂  浓度  活性 （%）
乙醇  ≤3%10%  100110
尿素  ≤0.5mol/L1.0mol/L1.5mol/L2.0mol/L  10011810782
DMSO  ≤1%10%20%  1005311
DMF  ≤5%10%20%  1008217
甲酰胺  ≤10%15%20%  1008639
SDS  0.001%0.01%0.1%  10510<0.1

应体系中所需要的性能。例如，Tbr和Taq聚合酶混合制剂(商品名为DyNA酶(MJ Research Inc.)，同时具有Tbr聚合酶的校正阅读功能和Taq聚合酶的高扩增效率的特性。相似的还有Taq和Pfu聚合酶的混合剂(商品名为Stratagene和Boehringer Mannheim)，能使长达35kb的长链模板核酸的PCR反应获得高产量的扩增产物。(表1-2)总结了几种常见的商品化的耐热DNA聚合酶的性能，以利于我们根据具体需要选择适合的聚合酶。
7. PCR反应促进剂：在有些情况下，可以向PCR反应体系中加一些助溶剂：例如甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油(glycerol)和一些添加剂：如氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等，以降低碱基错配率或提高PCR反应的扩增效率。这些助溶剂和添加剂即为PCR反应促进剂。大多数的PCR反应促进剂在高浓度时将会抑制PCR反应，见(表1-3)。因此在具体实验中应根据PCR反应体系中特定的模板DNA和引物的结合情况来决定PCR反应促进剂的最适浓度。通常在优化PCR反应体系时，应当首先考虑优化反应体系中的常规组成成分，尤其要考虑Mg2+和K+的浓度。
下面简要介绍几种常见的PCR反应促进剂的优化使用：
(1) DMSO：DMSO有变性DNA的作用，使用10%的DMSO对大肠杆菌DNA聚合酶Klenow I片断是有益的，但是对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此在一般反应中应尽量不用DMSO。然而，在复合PCR中可以用。
(2) 甘油：在反应体系中加入5%~20%的甘油有利于PCR反应中的复性，尤其对GC含量高和二级结构多的靶序列以及扩增片段较长的PCR反应中更为适用。但DMSO和甘油并非对所有的PCR反应都有益，应当根据实验的具体情况确定是否在反应体系中加入这些试剂。
(3) TMAC：在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可促进PCR反应，去除非特异性扩增而不抑制Taq DNA聚合酶。
(4) T4噬菌体基因32蛋白质(gp32)：向PCR反应体系中加入0.5~1µl的gp32(1mmol/L)可改善DNA聚合酶对长片段DNA的扩增。
(二) 循环参数
1. 变性：变性的温度取决于模板DNA分子的G+C含量和DNA聚合酶的热稳定性，而变性的时间与模板DNA链的长度及DNA聚合酶的热稳定性有关。在90℃~97℃的温度范围内，即使再复杂的DNA分子也可以变性成为单链。通常的变性温度和时间分别为95℃、30秒，有时用97℃、15秒。温度过高且时间
过长，Taq DNA聚合酶易失活且dNTPs破坏增多，从而对PCR反应产生不良影响。尽管DNA在其链分解温度(strandseparation temperature，Tss)时的变性只需几秒钟，然而要使反应管内部达到Tss还需要一定的时间，因此需要延长变性时
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发表于 2011-8-24 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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表(1-2)常见耐热DNA聚合酶的性能和使用条件
DNA聚合酶  供应商  来源  最适温度(℃)  外切酶活性  忠实性  稳定性(特定温度下活性保留时间)  缓冲液/pH(mmol/L)  盐浓度(mmol/L)  二价阳离子浓度(mmol/L)  其他附加成分
Taq DNA聚合酶  BM,LT,Pro,Start,P-E,T  T.aquaticus  75~80  5'→3'  低  97.5℃，9min  10 Tris-HCl/8.3  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  BSA,NP-40,Tween20
Stoffel片段  P-E  T.aquaticus  75~80  无  低  97.5℃，21min  10 Tris-HCl/8.3  10 KCl  2.0~10.0MgCl2  BSA,Tween21
rTth DNA聚合酶  BM,ET,P-E  T.thermophilus  75~80  5'→3'  低  95℃，20min  10 Tris-HCl/8.3  90 KCl  -  
Tfl DNA聚合酶  Pro  T.flavus  70  无  低  70℃，120min  50 Tris-HCl/9.0或20 Tris-醋酸/9.0  20（NH4）2SO4,70 醋酸钾  DNA合成1.5~5..0 MgCl2，反转录酶活性1.5~5.0MnSO4  0.5%Tween20在Mn存在时有较强的反转录酶活性
Hot Tub DNA聚合酶  Amr  T.ubiquitus    无  低    50 Tris-HCl/9.0  20（NH4）2SO4,  0.7~2.0MgCl2  
Tbr DNA聚合酶  Amr,Finnz  T.brockianus  75~80  5'→3'  低  96℃，150min  10 Tris-HCl/8.8  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  Triton X-100
UlTma DNA聚合酶  P-E,Roche  Thermotoga maritima  75~80  3'→5'  高  95℃，50min  10 Tris-HCl/8.8  10 KCl  1.5~5.0MgCl2  Tween20
rBst DNA聚合酶  ET  Bacillus sterothermophilus  60~65  5'→3'，3’→5’            
Isotherm Bst大片段  ET,Bio-Rad  Bacillus sterothermophilus  60~65    低         
Pwo DNA聚合酶  BM  Pyrococcus woesei  60~65  3'→5'  高  100℃，>2小时  10 Tris-HCl/8.85  20（NH4）2SO4,  1.5~4.0MgSO4  BSA,不能用dUTP
Tli DNA聚合酶  Pro  Thermococcus litoralis  70~80  3'→5'  低  100℃，100min  10 Tris-HCl/9.0  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  Triton X-100
Deep Vent DNA聚合酶  NEB  Pyrococcus strain GB-D  70~80  3'→5'  高  100℃，480min  20 Tris-HCl/8.8  10 KCl，10（NH4）2SO4,  1.5~5.0MgSO4  Triton X-100
Pfu DNA聚合酶  Start  Pyrococcus furiosus  72~78  3'→5''  高  95℃，240min  20 Tris-HCl/8.2  10 KCl，6（NH4）2SO4,  1.5~2.5MgCl2  BSA,Triton X-100
酶供应商：BM：Boehinger Mannheim，ET：Epicenter Technologies，LT：Life technologies，Pro：Promega，NEB：New England Biolabs，P-E：Perkin-Elmer，T：TaKaRa，Start：Stratagene，Amr：Amresco，Finnz：Finnzymes OY

表(1-3) 影响PCR反应的PCR反应促进剂的浓度
名称  抑制  促进
DMSO  >10%  5%
PEG  >20%  5~15%
甲酰胺  >10%  5%
甘油  >20%  10~15%
Tween 20  未测定  0.1%~2.5%
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间。通常在加入耐热DNA聚合酶之前先使模板在97℃下变性7~10min，再按94℃或95℃的温度进入循环。通常G+C含量约为55%的线性模板DNA分子的变性温度和时间为94~95℃45秒。此外在实际情况下，应根据模板DNA分子中的G+C的含量，耐热DNA聚合酶(表1-2)以及模板链的长度适当的调整变性的温度和时间。例如，当待增靶序列中的GC含量较高时，可以适当的提高变性温度或延长变性时间以利于模板DNA充分变性；当扩增较长的模板DNA时应当适当延长变性时间以保证模板DNA彻底变性；而扩增100~300bp的短片段时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5~10个循环后，可将变性温度降至87℃~90℃以改善PCR的产量。此外，由于环状DNA复性太快，通常待扩增的环状质粒DNA模板在扩增前最好先酶切线性化。为防止PCR反应液在变性温度下蒸发，可在反应管中加入1~2滴液体石蜡。
2. 退火：退火的温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的退火温度对于PCR的特异性尤为重要。一般来说，较低的退火温度可提高PCR反应的敏感性但其特异性较差，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性但却降低了其扩增效率。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。通常引物与模板的退火温度在45~55℃之间，一般情况下在Tm值允许的范围内选择偏高的退火温度以提高PCR反应的特异性。PCR反应体系的实际退火温度应根据所要求的PCR反应的特异性和灵敏度做出相应的调整。尽管有很多的公式可以用于计算引物的Tm值，然而这些公式并不是对所有长度的引物都适用，即对于每一特定引物我们并不能精确的计算出其Tm值。因此，优化退火温度的最理想的方法是设置一系列的对照反应。即通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。此外我们还可以通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的范围内由高到低的设定同一反应体系中连续的不同循环的退火温度从而确定最佳退火温度，这种方法避免了同时作多个平行实验的繁琐操作，并且避免了由于各平行实验中实验条件的差异带来的误差。在实际应用中不少研究者使用降落PCR的方法来确定最佳退火温度。退火温度一旦确定，退火的时间并不是关键性的因素，但退火时间太长会增加非特异性的复性从而降低反应的特异性，此外退火时间也不能太短，否则将导致引物模板复性不完全。
3. 延伸：尽管耐热DNA聚合酶可在较宽的温度范围内催化合成DNA，但是不合适的延伸温度仍可对扩增产物的特异性和产量造成影响。延伸温度取决于所使用的耐热DNA聚合酶的最适作用温度，一般为70~75℃。耐热DNA聚合酶在最适作用温度下可以获得最大的碱基掺入率，然而DNA聚合酶的碱基掺入率还受到所用的缓冲溶液、pH值、盐浓度、模板DNA性质的影响。当使用Taq DNA聚合酶时，通常延伸温度设定为72℃。延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度，在72℃时，Taq DNA聚合酶的碱基掺入率为35~100bp/秒，因此延伸速率为1kb/分。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当待增序列长达3~4kb时，则需延长3~4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下Taq DNA聚合酶的活性已足以完成靶序列的合成。通常在PCR的最后一轮循环中可以适当的将延伸时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。此外在实际操作中，应注意在前几轮循环中的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA的浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。
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4. 循环次数：PCR反应的循环次数和引物延伸效率决定着PCR反应的扩增程度。在其它条件已经优化的前提下，PCR反应的循环次数取决于待增靶序列的初始浓度。例如，当待增靶序列数分别为3×105、1.5×104、1×103和50拷贝分子时，最适循环数分别为25~30、30~35、35~40和40~45次。在PCR反应中，当扩增双链DNA中的一个小片段时，从第三次循环中扩增所需要的平端片段第一次出现开始，扩增产物依公式Nf=No(1+Y)n呈指数的形式积累，即PCR反应指数期。公式中Nf是靶序列的最终拷贝数，No 是最初拷贝数，Y是每轮循环的引物的延伸效率，n是扩增条件下的PCR循环数。在大多数情况下，一旦目的片段的最终拷贝数达到1012后，每次循环的效率就开始急剧的降低，此后产物不再以指数形式积累，PCR反应指数期终止。由于每一循环引物的延伸效率取决于反应体系中的耐热DNA聚合酶的性质，因此效率降低表明DNA 聚合酶已成为反应的限制因素。在PCR反应指数期内待扩增序列得到了最大限度的扩增，并且此期内靶序列的非特异性扩增极少并几乎可以忽略，而在此期以外的非指数期的PCR常常会导致非特异扩增、小的缺失或突变体的出现。因此PCR的许多应用都严格要求在PCR的指数期完成。一般情况下循环次数在25~40次之间，循环次数过多将导致非特异性扩增产物的增加，降低PCR反应的特异性；而循环数过少又会使PCR反应产量过低。在实际应用中，1012拷贝的特定序列足以满足分子生物学的绝大多数应用。同时，许多的实验室研究了PCR所用的不同的DNA聚合酶的效率(表1-4)，故只要知道反应体系中靶序列的最初拷贝数，就可以根据上述的公式计算出使最终拷贝数达到1012所需要的循环数。
(三) 其他因素
1. 热起动(hot start)：在PCR反应的第一次循环时，反应体系从较低的温度开始升温，由于耐热DNA聚合酶具有较广的作用温度范围，即在较低的温度下耐热DNA聚合酶仍然具有活性，而在反应体系加热的过程中，可能发生模板与引物的非特异性配对，这些非特异性配对可能在较低的温度下由耐热DNA聚合酶在其3’端加上几个碱基形成相对稳定的非特异性引物，在其后的扩增反应中，这些非特异性产物反复大量扩增，最终导致PCR反应严重失败。为了消除这种非特异性的扩增，可以采用热启动的方式，使耐热DNA聚合酶仅在反应体系达到较高的温度(>70℃)时才发挥作用。这种方法可以大大的提高PCR反应的特异性和敏感性。此外，由于在扩增前加热可以促进引物特异性复性和延伸从而增加了有效引物的长度，故可以减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。热起动的方法有几种：一种方法是在PCR反应系统中加入抗耐热DNA聚合酶抗体。抗体与耐热DNA聚合酶结合后，抑制耐热DNA聚合酶的活性。因此，在反应开始时，在较低温度下，虽然可能发生引物和模板的错配，但由于DNA聚合酶没有活性，不会引起非特异性的扩增。此后反应体系温度继续升高，当模板核酸热变性时，抗体在高温下失活，此后耐热DNA聚合酶释放，并在后续的延伸反应中发挥作用，介导特异性的DNA聚合反应。另一种方法使用石蜡将耐热DNA聚合酶与PCR反应系统分隔，因此在较低温度下也不会发生非特异性扩增。当反应体系升温达到热变性温度时，石蜡融化，耐热DNA聚合酶与PCR反应体系混合，从而在以后的步骤中发挥作用。
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2. 石蜡油：向反应体系中加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发后引起反应体系的体积和成分的改变。石蜡油必须是高质量、无菌的，不能含有抑制PCR反应的成分和污染物。加入的石蜡油的体积要求不太严格，通常以盖住反应液液面为度。
(四) 反应体系中各因素间的相互作用
PCR的循环参数、反应体系中各组分及其它反应条件都是相互影响的，任何因素的改变都将引起其它反应条件的变化，从而直接影响PCR反应的结果。因此PCR反应的结果是以各种反应条件为自变量的多元函数。由于各种不同反应体系都有其最适反应条件，故只有PCR反应体系在最适反应条件下，方能达到最佳扩增结果。

表(1-4) 常见耐热DNA聚合酶不同条件下的效率、错误率和最适循环数
酶  dNTP(mmol/L)  pH  Mg2+(mmol/L)  每循环的效率(%)  错误率(错误/掺入碱基对)  PCR引起的突变  需要的循环数
pfu  0.1  8.4  1.5  60  7×10-7  0.3  30
Vent  0.5~1.5  85  75  70  4.5×10-5  16  26
Taq  0.5~1.5  8.0  5  36  7.2×10-5  25  45
Taq  16.6  8.8  10  88  2×10-4  56  22

二、 PCR反应的忠实性
PCR反应的忠实性即PCR扩增反应的产物的核酸序列应当与待增靶DNA分子的序列高度一致。PCR反应的忠实性是衡量一个PCR反应体系的扩增效率的重要指标之一，因此了解PCR反应的忠实性的特点及其影响因素是极其重要的。
(一) PCR反应的特异性、忠实性和扩增效率的关系
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。特异性指PCR反应的扩增产物之间的一致性，即反应扩增产物的序列是相互一致的。高度特异的PCR反应要求扩增产物中可以检测到的非特异性扩增尽可能少。忠实性指扩增产物的序列与模板DNA的序列相符合的程度。高度的忠实性即PCR扩增产物中几乎没有由DNA聚合酶引起的碱基错配。理想的PCR反应应当是高度特异和忠实的。然而，由于常用的耐热DNA聚合酶没有Klenow片段的校正阅读功能，因此虽然在合理控制反应条件的前提下可以使PCR反应获得高度特异性却不能避免由于耐热DNA聚合酶的特性决定的碱基错配，故有高度特异性的PCR反应的忠实性不一定高。此外，PCR反应体系中的各种成分、循环参数等众多因素都影响着PCR反应的忠实性、特异性和扩增效率，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性以及高产量所需要的反应条件并不一致，因此在具体的PCR反应中应优先考虑对预期结果最为重要的参数，在此前提下优化反应条件。例如，在对细胞的均一群体的直接序列分析中，PCR反应的产量和特异性比忠实性更重要，而在研究个别DNA分子或者不均一群体中的稀有突变中，PCR反应的忠实性就显得比其他两个参数重要的多了。
(二) 影响PCR反应的忠实性的因素
PCR反应体系中的各种组成成分以及循环参数等诸多因素对PCR反应的忠实性都有不同程度的影响，其中最为显著的是模板数、dNTP浓度以及聚合酶的种类等。
1. 模板核酸浓度：由于一旦由聚合酶引起的碱基错配被引入，这些错误序列将随着模板的“正常序列”一起呈指数形式扩增。因此，由聚合酶引起的错误序列所占的比例将随着扩增循环数的增加而增大。当使用微量模板DNA进行PCR反应时，将大大的增加由聚合酶引起的错配序列的比例从而影响PCR反应的忠实性。例如，使用Taq pol进行PCR反应，Taq pol的碱基错配率约为10-4。当进行PCR反应的模板数仅为10个拷贝时，虽然碱基错配的发生概率并不高(10-3)，然而一旦发生碱基错配，这种错配将占PCR终产物的10%。而使用大量的模板DNA(105)后，虽然在PCR的第一个循环中将可能引起10个碱基错配(聚合酶仍为Taq pol)，而这些错配只占PCR终产物的1/105。因此，通常在反应体系中加入的模板数应为102~105拷贝。
2. dNTP浓度：研究表明，当反应体系中的dNTP浓度明显低于Km值(dNTP<1µmol/L)或者某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错配碱基的掺入。由于聚合酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的识别，因此这些错误掺入的碱基有利于链的终止从而有助于保持反应的忠实性。然而，当dNTP浓度过高(>1mmol/L)时则会促进错配碱基的延伸。因此，在PCR反应体系中应采用较高浓度的dNTP，且四种dNTP的浓度应相同。通常，当每种dNTP浓度为10~50µmol/L时，能够最大程度的保持PCR反应的忠实性。
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3. 耐热DNA聚合酶：尽管通过优化反应体系中的缓冲液、靶序列等反应条件可以大幅度的提高由Taq、T7和Vent DNA聚合酶介导的PCR反应的忠实性，但是其忠实性还是远差于pfu和T4聚合酶的水平，且聚合酶的一些内在性质对PCR反应的忠实性也有较大影响。因此当对PCR反应的忠实性要求较高时，最好应用具有校正阅读活性的聚合酶。
此外反应体系中的缓冲液等其它反应条件也对PCR反应的忠实性有着较大的影响。在具体的反应中，应根据具体情况优化模板DNA、dNTP、耐热DNA聚合酶和缓冲体系等反应条件，力求最大程度的保持PCR反应的忠实性。
三、 平台效应
在PCR反应的后期扩增产物的增加因呈指数方式而变成平坦的曲线，同时出现大量的非特异性扩增，这种现象称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：
1.  随着反应的进行，dNTP和引物的浓度不断的降低。
2.  随着产物的增加，酶对模板的比率降低。
3.  由于变性温度较高，多次循环后酶的活力和dNTP的稳定性逐渐降低。
4.  反应体系中产生的非特异性产物或引物二聚体与反应底物竞争聚合酶。
5.  反应产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸。
6.  当产物浓度高于10-8mol/L时，可能降低Taq聚合酶的延伸加工能力或引起产物链的分支迁移和引物转换。
7.  酶与PCR的产物结合，使酶分子减少。
因此我们应当控制PCR的循环次数在合理的范围，使反应在指数扩增期内完成。
第五节 PCR产物的检测
PCR反应完成后，必须通过严格的检测分析以确定是否得到准确可靠的特定扩增产物。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法，在具体实验中我们可以根据具体研究对象和研究目的以及具体实验条件而采用不同的检测法。常见的PCR产物的检测分析法有凝胶电泳法、核酸探针杂交法、酶谱分析法、DNA酶免疫试验法、PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)、颜色互补分析法、序列分析法、PCR-HPLC法、单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)、PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)和单链构型多肽性分析法等。
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一、 凝胶电泳检测
凝胶电泳是检测PCR产物最常用、最简便的方法。通过凝胶电泳检测，我们可以判断PCR反应扩增产物的大小。根据检测的目的基因不同，PCR扩增后可产生不同大小的扩增片断，如大片断的扩增产物其分子量大，在凝胶电泳中的泳动速度就慢，而小片断的扩增产物在电泳中的泳动速度则快，因此，通过凝胶电泳判断扩增片段的大小就可以满足检测的需要。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于检测大于500bp的DNA片段，而后者则主要用于检测小片段的DNA。
(一) 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是实验室中最常用的PCR产物检测方法，操作简便易行，仅需要少量的扩增产物即可进行检测。其原理是在琼脂糖凝胶电泳时，由于不同大小的DNA分子所带电荷的差异而具有不同的电泳速度，从而在琼脂糖凝胶中分离，然后经溴化乙锭(E染色后在紫外光照射下使其发射荧光从而确定其在凝胶中的位置。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，虽然琼脂糖凝胶电泳的分辨率较低，但其分离范围较广，从100bp~50kbp。琼脂糖凝胶电泳的检出率在1~10ng DNA以上。
(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与琼脂糖凝胶电泳相同。与琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺电泳具有如下的优点：①分辨率很强，长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开；②能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶，多达10µg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽(1㎝×1㎝)而不致显著影响分辨力；③从凝胶中回收的DNA纯度很高。
凝胶电泳检测法，扩增产物显示的方法主要有溴化乙锭(E染色和银染法两种。
二、 核酸探针杂交检测
(一) 核酸探针杂交检测法是鉴定PCR扩增产物特异性的一种重要手段，常用的方法有：
1. 点杂交：其基本过程是：首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用放射性或非放射性的标记物标记的探针杂交。
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