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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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2. 反向斑点杂交：将不同的探针先固定到膜上，然后使用标记的扩增产物杂交。
点杂交在当扩增出现多条带或者存在非特异性扩增掩盖作用时，可用来鉴定扩增产物的特异性，有助于产物的分型方法及法医学鉴定，可以同时检测多个突变位点或多种病原体。
3. Southern杂交：首先从被扩增的DNA片段的中间区域设计一个特异性的DNA探针，并用同位素或生物素等标记。然后采用常规的Southern杂交法，将PCR扩增产物经常规的琼脂糖凝胶电泳后转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后与探针进行特异性杂交。该法可以鉴定产物的大小及产物的特异性并且其检测灵敏度可达10ng。
4. 微孔板杂交法：将与PCR产物互补的DNA探针固定于微孔板上作为捕获探针，然后与标记的PCR扩增产物杂交。
5. 微孔板夹心杂交：通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR扩增产物的某一区域的特异杂交使产物间接的固定于微孔板上，然后再用另一标记的检测探针与PCR扩增产物的另一区域杂交。这种方法使用两个杂交过程检测一个PCR产物，因此其特异性较一次杂交的强。
(二) 核酸探针的标记可分为放射性标记和非放射性标记两类。
1．放射性标记：常见的放射性核素标记物有P32、H3和S35。放射性核素标记的探针具有高度的特异性和敏感性，可以检出1~10µg的高等生物基因组DNA中的单拷贝基因，然而由于放射性污染限制了其应用。
2. 非放射性标记：常用的非放射性标记物有下述几类：⑴半抗原，例如生物素(biosin)、地高辛等；⑵配体，例如生物素不仅是半抗原，它还是亲和素(avidin)的抗体，故可以使用生物素-亲和素反应进行杂交信号的监测；⑶荧光素，例如异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明类，可以在紫外光的照射下激发产生荧光；⑷化学发光标记物，即一些可以通过与某种物质反应产生化学发光现象的一类标记物。由于非放射性标记物具有稳定性较好、安全性强的特点，因此通常的核酸探针标记采用非放射性标记物。
三、 酶谱分析法
酶谱分析法是鉴定PCR扩增产物特异性的一种简便方法。其原理是首先根据已知的PCR扩增靶序列查出序列中所含有的限制性内切酶的酶切位点，然后选择合适的限制性内切酶消化PCR扩增产物后进行电泳分析，分析比较PCR酶切产物的电泳图谱与已知的序列资料，从而判定PCR扩增产物的特异性。
四、 DNA酶免疫试验法(PCR-EIA)
DNA酶免疫试验法是一种以特异杂交的双链DNA为抗原，与一般标记的抗体进行显色反应从而检测PCR反应扩增产物的技术。其结合了PCR反应扩增的敏感性及酶联免疫反应的简便性的特点，特别适用于同时对大量扩增产物的分析。通常的方法是：将扩增产物与一特异ssRNA探针杂交，通过包被于微孔板内的抗DNA-RNA双链特异的单克隆抗体将杂交体固定于微孔板上，然后再用酶标抗DNA-RNA双链抗体进行酶联显色。
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五、 PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)
本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规的ELISA计数仪检测。首先对PCR反应的引物5’端进行修饰，使一个引物的5’端携带便于PCR产物固定的功能基因，如生物素等，而另一个引物的5’端则携带便于酶联免疫检测的功能基因，如酶或抗原、抗体等。通过包被于微孔板中的活性基团(如亲和素)将PCR反应产物固定于微孔板上，然后进行酶联显色检测。该法不仅可以鉴定PCR产物的特异性，而且可以用于PCR产物的定量分析。
六、 颜色互补分析法
颜色互补分析法利用三原色原理，当不同的DNA片断同时扩增时，用不同的荧光染料标记不同引物的5’端，经过PCR反应扩增后，带有不同染料的DNA片段由于颜色互补而易于区分。此法简便，可以自动化。可用于检测基因缺失、染色体转位和病原微生物。
七、 序列分析法
即将PCR的产物直接进行测序分析，该法是PCR产物分析最精确的方法，但也是最繁琐的方法，最常用的是Sanger双脱氧链终止测序法。本法可以精确的检测基因突变。
八、 PCR-HPLC法
将PCR反应扩增产物通过高效液相色谱(HPLC)仪自动分析，其原理是利用异源双链与同源双链的解链特征不同，在部分热变性的条件下，通过异源双链与同源双链在DNA色谱柱中保留的时间差异，检测DNA的突变，与传统检测基因突变的方法相比，该法具有经济、高效、高通量和自动化的优点，该法还可用于PCR反应产物的分离制备。
九、 单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)
SNUPE(也可称为引物指导的核苷酸掺入试验)是用于检测PCR扩增产物是否存在已知点突变的一种方法。该法依赖于DNA聚合酶的忠实性，即在引物与模板复性后，DNA聚合酶仅在引物的3’端加上一个与模板正常配对的碱基。因此，可以设计一种引物，使其在与PCR扩增产物杂交后，其3'端紧邻突变位点上游。在SNUPE反应中止后，加入一种已知的放射性或非放射性标记的核苷三磷酸，仅当引物3’端的模板碱基与加入的dNTP 完全配对时，DNA聚合酶才催化延伸一个核苷。然后反应产物可经过电泳分离，就可以很容易的识别延伸的碱基，从而判断碱基的突变情况。此外，也可以向反应体系中加入不同标记的碱基，延伸反应后，可以根据碱基标记物的不同来识别突变的种类。
十、 PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)
该法用于检测PCR扩增产物中的点突变。其原理是设计两个可与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸，使其与PCR反应产物杂交后，用DNA连接酶使其正常配对的相邻的碱基共价连接，而通过调节连接酶和NaCl的浓度可防止错配碱基之间的连接，连接产物可用凝胶电泳鉴定。
十一、 单链构型多态性分析法(PCR-SSCP)
该法用于分析PCR产物中的突变和序列多态性。其原理是双链DNA变性后(甲酰胺处理)，单链DNA通过分子内碱基配对重新折叠，单链核苷酸序列的微小变化，包括点突变、缺失和掺入都会影响单链分子的终构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时引起电泳迁移率的改变。
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第六节 PCR产物的纯化
使用PCR反应完成目标DNA的扩增后，PCR反应的扩增产物可以用于进一步的研究，例如用于DNA测序、PCR产物的克隆、分析基因的功能和表达等。然而，通过PCR反应后反应体系中仍然存在着具有活性的DNA聚合酶，剩余的dNTP、引物以及反应缓冲体系中的各种金属离子等，因此我们必须通过一定的方法从反应体系中提纯PCR反应的扩增产物，才有利于进一步的分析研究。然而，实验表明使用常规的酚∶氯仿、乙醇沉淀等提取法并不能分离和灭活耐热DNA聚合酶。而这些存活的DNA聚合酶对后续的PCR产物的克隆等研究造成不同程度的影响，例如DNA聚合酶会使由限制性内切酶消化产生的3’末端凹陷被重新填充，因此耐热DNA聚合酶的灭活分离一度成为多个实验室克隆PCR扩增产物中遇到的一大难题。常规的PCR产物纯化的基本过程如下：首先使用琼脂糖凝胶电泳分离除去反应体系中靶序列的非特异性扩增片断，然后使用蛋白酶K灭活耐热DNA聚合酶，此后使用常规的酚∶氯仿抽提法除去剩余的dNTP，离心、乙醇洗脱后干燥，最后使用高效液相色谱或者凝胶电泳分离反应体系中剩余的引物和引物二聚体。通过琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色可以鉴定所提纯的PCR反应产物的纯度。

(邓兴力 王廷华)


参 考 文 献
1  Joseph Sambrook, David W. Russell. Molecular Cloning. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, Third Edition.
2  J. 萨姆布鲁克，E.F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯著．分子克隆．北京：科学出版社，2002，第二版.
3  姜军平主编.实用PCR基因诊断技术.西安:世界图书出版公司,1996,第一版.
4  丁振若,苏明权主编.临床PCR基因诊断技术.西安:世界图书出版公司,1998,第一版.
5  C.W.迪芬巴赫,Q.S.德维克勒著.PCR技术实验指南.北京:科学出版社,1998,第一版.
6  林万明主编.PCR技术操作和应用指南.北京:人民军艺出版社,1998,第一版.
7  吴乃虎主编.基因工程原理.北京:科学出版社,2000,第一版.
8  张迺蘅主编.医学分子生物学.北京:北京医科大学出版社,1999,第一版.
9  徐晓利,马涧泉主编.医学生物化学.北京:人民卫生出版社,1998,第一版.
10  高天祥,田竟生主编.医学分子生物学.北京:科学出版社,2000,第一版.
11  冯作化主编．医学分子生物学．北京：人民卫生出版社，2001,第一版.
12  R.M. 怀特曼著.高级分子生物学要义.北京:科学出版社,2000,第一版.
13  B.D. Hames, N.M. Hooper, J.D. Houghton. Instant Notes in biochemistry. 北京:科学出版社,1999,第一版.
14  Malacinski.G.M.分子生物学精要.北京:科学出版社,2002,第一版.
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第二章 DNA模板的制备及PCR技术
中常见问题的处理
PCR反应体系包括DNA模板、反应缓冲液、dNTP、引物和酶等。为了获得满意的结果，DNA模板的数量和质量都直接影响到PCR的扩增结果。因此从生物标本中提取DNA要尽可能选择快速有效地能使DNA游离出来的方法。人类基因组DNA98%以上以染色质的形式存在于细胞核内，少量存在于线粒体内。从人体组织的有核细胞中均可提取到DNA，提取DNA主要是通过低渗或高渗的方法使细胞裂解，加入适量去垢剂(SDS)或煮沸使核模破裂，核内DNA释放，再采用化学方法除去蛋白质、RNA及其它大分子，获得纯化的DNA。
不同的分析技术对DNA样本的要求是不同的，如DNA指纹图分析要求DNA量要达到μg水平，而PCR技术因其灵敏度高，DNA量只要达到ng甚至pg水平就可满足分析的要求。不管DNA样本量要求是多少，任何DNA分析技术，都需要高质量的DNA样本。因为任何非DNA物质都会影响酶的作用，引起DNA降解。
较理想的DNA样本应达到以下三点基本要求：(1)最大限度地除去样品DNA溶液中的RNA、蛋白质、多糖和脂类分子成份；(2)尽可能保持DNA分子结构的完整性；(3)尽可能除去对酶有抑制作用的物质，如有机溶剂、去污剂、金属离子、染料等。
第一节 DNA模板的制备
提取DNA的基本原理是利用DNA和蛋白质对提取过程中各种试剂如蛋白酶、有机溶剂等不同的反应和溶解性来达到分离的目的。目前常用的方法有：(1)有机提取法；(2)Chelex-100提取法；(3)无机提取法；(4)其他提取方法。
一、 有机提取法
苯酚/氯仿提取DNA是最经典的有机提取方法，该方法适宜于所有生物样本的DNA提取。
(一) 原理
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
(二) 基本试剂
1. TES：10mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA。
EDTA是一种螯合剂，可抑制金属离子的酶激活作用，在碱性条件下可以抑制核酸内切酶，保护DNA分子的完整性。
2.  SDS：10%(W/V)SDS.
SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子去垢剂，其主要作用是增加细胞膜、核膜的通透性；促进DNA分子与核蛋白分离并游离出来；促使核酸酶及蛋白质变性。
3.  蛋白酶K：2mg/ml或10mg/ml。
蛋白酶K的主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，是DNA提取的关键试剂。
4.  苯酚
市售的苯酚在使用前需按下述步骤制成饱和酚。
(1) 用专门的蒸馏装置将苯酚加热蒸馏，分装于棕色瓶中，冷却后–20℃保存。
(2) 使用前将重蒸酚置于水浴溶化，取250ml加入500ml棕色瓶中，加入1mol/L pH8.0的Tris-HCl，间断振荡。24h后弃上清，再加入0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl，0.25g的8-羟基喹啉，使终浓度达0.1%。加巯基乙醇使终浓度达0.2%。平衡使上层水相pH 达8.0，4℃避光保存。
苯酚的pH6.0，呈酸性，在酸性环境下DNA可溶于有机溶剂，且酸性条件可使DNA变性降解，因此在提取DNA前，苯酚需用Tris-HCl平衡至pH8.0，以防酸性苯酚溶解DNA。
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5.  氯仿、异戊醇
氯仿的作用是使蛋白变性，除去蛋白酶、去垢剂及残留蛋白。其次氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离及除去酚抽提后水相中残留的酚。异戊醇的作用主要是消除在抽提过程中产生的泡沫。
用酚/氯仿抽提DNA配制的比例为：酚:氯仿:异戊醇=24:23:1。
6.  细胞裂解液
0.64mol/L蔗糖，0.01mol/L MgCl，20mmol/LTris-HCl(pH7.6)，1%TritonX-100，4℃保存。
(三) 提取步骤
各种生物样本(血液、组织、骨、牙齿等)的预处理不尽相同，而预处理后，提取DNA的过程则是相同的，现在将各种常见生物样本的DNA提取方法分述如下。
1.  血液DNA的提取
(1) 预处理
将抗凝血2000r/min离心5min，弃上清，加2倍体积红细胞裂解液，置室温或37℃水浴1h，离心2000r/min，5min，弃上清，如此反复2次。
(2) 于上述沉淀物中加适量TES液洗涤一次，2000r/min，离心5min，弃上清，加TES 400µl，1/10体积10%SDS，10mg/ml蛋白酶K至终浓度为100µg/ml。上下转动混匀后置37℃-42℃水浴保温过夜。温浴过程中，可反复混匀反应液几次，以使细胞充分裂解，消化蛋白质。
(3) 抽提DNA
1) 取出温浴消化后的细胞处理液加等体积苯酚氯仿抽提液(苯酚:氯仿:异戊醇=24:23:1，v/v/v)，上下颠倒离心管5-10min，使水相与酚充分混合呈乳状悬液，10000r/min离心5min，将上层水相移至另一离心管，如此反复抽提二到三次。
2) 于水相抽提液中再加入氯仿、异戊醇(氯仿:异戊醇=24:1，v/v)上下翻转抽提一次，10000r/min离心5min，将上清液取出至另一离心管中。
(4) 沉淀DNA
于上述抽提液中加入1/10体积的3mol/L NaCl及2倍体积冰乙醇，缓慢上下翻转离心管，观察有无絮状DNA沉淀出现，用牙签小心挑出沉淀置0.5ml离心管中，加入70%乙醇，10000r/min离心5min，弃上清，置真空干燥箱中干燥。如无明显絮状沉淀出现，直接离心10000r/min，5min，弃上清，加入200ml70%乙醇洗涤1次，10000r/min，离心5min，弃上清，去除残留的盐。真空干燥。
(5) 溶解DNA
于干燥的DNA中加入适量TE 10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA或pH8.2的水溶解DNA备用。
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DNA含量的检测
取2-5µl DNA溶解液与0.4µl 6×载样缓冲液混合，用0.75%琼脂糖凝胶(含EB 0.5µg/ml)检测。溴化乙锭可迅速嵌于DNA双螺旋结构中，嵌入DNA中的溴化乙锭受紫外光激发而发出荧光，这种荧光强度与DNA总质量数成正比，通过比较样品与标准品的荧光强度，对样品中的DNA进行定量。
检测DNA含量的另一方法是分光光度法，组成DNA的碱基，具有一定的吸收紫外线的特性，其最大吸收值在波长250-270之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外线的特性没有改变，核酸的最大吸收波长为260nm，利用DNA的这个物理特性来测定DNA的浓度。
分光光度法的具体方法是：1、取两只清洁的比色杯，各加入2ml 0.1mol/L NaOH校正零点。2、以其中的一只比色杯作为空白对照，在另一只比色杯中加入4µlDNA溶液，再加入0.1mol/L NaOH至2ml混匀。3、测定波长为260nm时的OD值，再将波长调至280nm测其OD值。4、根据OD260=1时，双链的DNA浓度为50µg/ml，单链DNA或RNA浓度为40µg/ml，按计算公式：样品DNA浓度(µg/ml)=OD260×40µg/ml×稀释倍数，计算样品的DNA浓度。
(7) 提取DNA的注意事项
1) 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
2) 酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。
3) DNA提取过程中，DNA分子失去了核蛋白的保护，易受物理性外力作用而断裂。因此，在抽提DNA的过程中均忌动作粗暴，以免将DNA分子打断。
4) 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
5) 苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
2. 石蜡包埋组织、固定组织的DNA提取
石蜡包埋组织和固定组织是分子生物学研究的重要材料来源。经甲醛固定的组织，组织中的核酸与甲醛反应，早期在碱基中出现快速可逆转的羟甲基化；数天后在碱基对间，核酸与蛋白质之间缓慢地形成不可逆转的亚甲基交联。甲醛固定的时间、温度和酸碱度等均对核酸有影响，一般来说，强酸可导致DNA完全解聚而弱酸也能引起DNA结构的改变。当pH值低于2.5时，几乎所有的碱基之间氢键解离，DNA双链断裂产生不可逆的变性。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA显示重复DNA序列的特异性内切酶的酶切点和特异性卫星带，说明DNA被完全消化。因此，不同固定剂对DNA的固定是有差异的，福尔马林类固定剂影响最大，而乙醇或含乙醇类固定剂的影响较小。
(1) 甲醛固定组织DNA的提取
剪取甲醛固定的组织，用蒸馏水冲洗2－3次，剪碎或匀浆，用2×蔗糖－Triton X-100裂解液(0.6mol/L蔗糖，0.02mol/L Tris-HCl pH8.0，0.01mol/L MgCl2，2%Triton X-100)清洗，3000r/min离心15min，收集沉淀，在沉淀中加入1.5ml　TES混匀，加入10%SDS和蛋白酶K，使终浓度分别为1%和200µg/ml，50℃水浴保温48－60小时，如果溶液仍有许多不溶物可增加SDS和蛋白酶K的浓度或延长消化时间。苯酚氯仿的提取步骤同血液DNA的提取。
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(2) 石蜡包埋组织DNA提取
1) 将石蜡包埋的组织切片，置于1.5ml离心管中，加入500-1000ul二甲苯旋涡混匀，置室温脱蜡30min，2000r/min离心5min弃上清，再用二甲苯重复处理一次。
2) 于离心管中加入1000ul无水乙醇洗涤沉淀，12000r/min 离心5min，弃上清，重复一次，再用70%乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，弃上清。
3) 加TES100-200ul，加蛋白酶K至终深度为300μg/ml，42℃水浴过夜。
4) 苯酚/氯仿抽提同血液DNA提取。
(四)注意事项：
1.  取材时应避免出血坏死的组织，尽可能选用新鲜的标本。
2.  消化时应不时震摇离心管，使酶与组织充分接触。
3. 福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，匀浆的效果往往不理想，可将组织切成10um的薄片进行消化。
4. 消化不完全，可采用高浓度蛋白酶K及延长消化时间。
二、 Chelex-100提取DNA
(一)原理
Chelex-100是一种化学螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲合力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，DNA游离。
(二)基本操作方法
Chelex-100特别适用于微量生物样本的处理，方法简便快速，提取过程始终在同一管中进行，不用转移，可减少DNA的损失，操作步骤简化，减少了污染的机会。以血液为例将基本操作步骤叙述如下：
1. 取血液1-3µl，置1.5ml离心管中，加灭菌双蒸水1ml，振荡混匀，室温30min，或置冰箱-20℃ 5min。
2.  10000r/min离心5min，弃上清，反复2-3次。
3. 于沉淀中加入200µl悬浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴过夜。
4.  振荡5-10秒，置100℃ 5-10min，取出振荡溶液5-10s。
5.  10000r/min 5min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。
(三)注意事项
1. Chelex-100处理模板仅适用于PCR反应，处理液不宜长期保存，如果保存的时间稍长，可将上清液转移至另一管中保存备用。一般在一周内使用，如果保存时间过长则会影响PCR扩增结果。
2. 在处理模板的各个步骤中，振荡要充分。
3. 煮沸的温度、时间要充分，否则将影响扩增。
4. 使用前要混匀离心，取上清液作为模板，如果PCR反应体系中含有Chelex-100，Mg2+会被螯合，降低酶活性，使PCR扩增失败。
三、 无机法提取DNA
无机提取法是利用6mol/L NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替酚氯仿抽提去除蛋白质。基本方法是：在消化的DNA溶液中加入3倍体积6mol/L NaCl，剧烈振荡混合，10000r/min离心10min，去沉淀，上清液用无水乙醇沉淀DNA，此方法得到的DNA盐浓度较高。
四、 差异裂解提取法
差异裂解提取法，主要是用于对涉及法医物证鉴定的生物样本提取，如阴道液与精液的混合，在提取精液中精子的DNA时，由于精子细胞膜和核膜含有大量的硫醇蛋白，具有丰富的二硫键，在处理中，精子的细胞膜和核膜不如脱落上皮细胞、血细胞膜那么容易破膜，因此，利用精子的这种特性，在处理精液与其它成份混合的样本时，可以先除去其他成份，再加特殊的化学试剂二硫代苏糖醇(DTT)使精子细胞的二硫键打开从而提取精子的DNA。这种处理过程就是差异裂解提取法。具体的操作方法同血液DNA的提取。
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发表于 2011-8-24 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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五、 其他方法提取DNA
(一) 硅珠法提取DNA
1. 原理
在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，DNA能够被二氧化硅特异性吸附，当没有硫氰酸胍存在时，DNA又可从二氧化硅中释放出来。硫氰酸胍是一种高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质及一些不溶的物质除去。吸附后的漂洗过程则可将溶液中的PCR抑制物洗去。
2. 试剂
吸附剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，0.8ml 0.5mol/L EDTA，0.5ml TritonX-100。
漂洗剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。
硅珠悬浮液：0.06g Silica溶于1ml灭菌超纯水。
TES：1ml1mol/L Tris-HCl pH8.0，2ml 5mol/L NaCl，2ml 0.5mol/L pH8.0 EDTA，95ml灭菌超纯水。
3. 方法
取1.5ml离心管1支，加入TES200ul，10%SDS40µl再加入血液2-4µl，混匀，煮沸5min，振荡混匀，加入300-600µl吸附液，混匀，加入20-40µl硅珠悬浮液，振荡混匀，置室温15min，振荡5s，10000r/min离心2min，除去上清，于沉淀中加入200-400µl漂洗液，充分悬浮沉淀物，10000r/min离心1min，去上清液，重复漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min 5min，去乙醇，置56℃　10min，于沉淀中加入50-100µlTES，旋涡混合30s，56℃保温10min，10000r/min离心10min，上清液可直接用于PCR反应。
(二) 固相吸附法提取DNA
1. 原理
硫氰酸胍具有溶解细胞和灭活核酸酶的性质，利用当硫氰酸胍存在时硅藻颗粒能特异性吸附DNA，而当去除硫氰酸胍时，DNA又能从硅藻上释放出来的特性，来提取样本中的DNA。该方法尤其适用于临床标本的DNA提取。
2. 试剂
裂解液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4，2.2ml 0.2mmol/L EDTA pH8.0，0.3ml TritonX-100。
洗涤液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4。
3. 方法
(1) 取100µl样品加900ul裂解液，20µl硅藻液，振荡混合，10000r/min离心1min，去上清。
(2) 加1ml洗涤液，悬浮沉淀洗涤，10000r/min离心1min，再重复一次。加1ml 70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃　10min。
(3) 加60µl TE缓冲液混匀，56℃　10min，10000r/min离心5min，上清液备用。
(三) 磷酸缓冲液法
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发表于 2011-8-24 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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1. 原理
细胞在含非离子去垢剂和蛋白酶K的溶液中消化后，高温加热使蛋白质、酶类及蛋白酶K失活，离心沉淀分离蛋白质。
2. 试剂
(1) 细胞缓冲液：0.85% NaCl，66mmol/L Na3PO4 pH7.0。
(2) 蛋白酶K 10mg/ml。
(3) 10%SDS
(4) PCR缓冲液：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.3，2.5mmol/L MgCl2，0.1mg/L白明胶, 0.45%NP-40, 0.45% Tween-20。
3. 方法
(1) 取10-20ul血液加500ul(1)液，10000r/min离心1min，去上清液，反复2-3次。
(2) 于沉淀中加入(4)液400-500ul，10% SDS20ul，蛋白酶K 0.06μg/μl。混旋，56℃温浴1h。
(3) 100℃煮沸10min，10000r/min离心5min，上清液备用。
本方法只适用于提取新鲜样本如血液、痰液等。
第二节 PCR常见问题及处理
PCR反应受到DNA模板、引物、dNTP、Taq聚合酶、反应缓冲液等诸多因素的影响。
一、 PCR扩增参数对扩增目的基因的影响
(一) PCR缓冲液
PCR缓冲液浓度改变可影响PCR扩增，一般标准的缓冲液成份为10-50mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，1% TritonX-100或0.001%白明胶。Tris是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲能力，会引起PCR扩增效率的改变。反应液中的KCl浓度在50mmol/L下有利于引物的退火，如果超过50mmol/L的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+浓度不仅影响酶活性，同时也影响着引物的退火、模板与PCR产物解链温度、产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过高时会导致非特异性扩增产物增加，而Mg2+浓度过低，则会限制聚合酶的活性。
(二) 引物浓度
引物浓度的改变会影响扩增的产量。
(三) 四种三磷酸脱氧核苷酸
在PCR反应中，四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的终浓度为20-200μmol/L，在此范围内，PCR特异性和PCR产物的量可以达到最佳状态。如果dNTP的终浓度大于50mmol/L，DNA聚合酶的活性会被抑制。
(四) Taq聚合酶浓度
Taq聚合酶是PCR反应的关键因素之一，PCR反应要求Taq酶具有良好的热稳定性。一般50μl反应体系中Taq酶的用量为1-2.5u，当反应体系中Taq酶量大于5u，非特异性扩增产物会增加。
(五) 温度循环参数
变性和退火温度与时间，延伸温度与时间以及循环参数都决定着PCR扩增产物的量和特异性。
二、 PCR常见问题及处理
(一) 没有扩增产物
1. 循环温度特别是解链温度是否正确，对于富含G+C的目的基因97℃的温度可以使解链更加有效，但过高的温度会影响酶的活性，有效的解决方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97℃-95℃变性5-10min。有的PCR仪由于长期使用，其所显示的温度与实际温度不一致，应定期对仪器进行维护及测试。
2. 引物的组成是否正确，有无二级结构的形成。
3. 聚合酶的活性是否正常。
4. 反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物的降解。将模板置95℃以上处理，可以抑制蛋白酶和核酸酶的活性。
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发表于 2011-8-24 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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5. 某一些样本，蛋白质成份除去不完全，这样可以抑制PCR反应，再用蛋白酶K重新处理样本，可提高扩增效率。
(二) 有非特异性产物形成或产物在电泳凝胶中呈涂布状
1. 提高退火温度，缩短退火及延伸时间。选择合适的退火温度可以提高PCR反应的效率，大大减少引物与模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。引物的退火温度与时间取决于引物的碱基组成(G+C的含量)、长度和浓度。
2. 调整引物、TaqDNA聚合酶或模板用量。PCR反应中引物的终浓度一般为0.1-1μmol/L，如果引物浓度低于0.1μmol/L时，PCR产物产量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导合成非特异产物，增加引物二聚体的形成，如果引物二聚体出现在早期的循环中，可成为PCR反应的模板，与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。TaqDNA聚合酶在70-75℃时具有最高的生物学活性，75-80℃条件下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸。温度降低时，TaqDNA聚合酶延伸速度明显下降。
3. 调整Mg2+用量。Mg2+影响着TaqDNA聚合酶的活性，同时还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低，过高时，则酶催化非特异性扩增。
4. 减少循环次数。循环次数决定着扩增程度，过多的循环会增加非特异扩增产物，过少的循环次数，PCR产物量就会极低。
(三) 引物二聚体的形成
1. 检查引物的序列，特别在3'端是否有互补区。
2. 提高退火温度。
3. 调整引物与模板浓度，使模板比例增高。
4. 增加引物长度。
5. 减少循环次数。
第三节 PCR技术中污染问题
一、 污染原因
(一) 样品间交叉污染
样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢出容器外，或容器外粘有其他样品而造成相互间交叉污染；样品DNA在提取过程，由于微量移液器(加样枪)污染导致样品间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二) PCR试剂的污染
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于吸样枪、容器、双蒸水及其它溶液被其它样品污染。
(三) PCR扩增产物污染
这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性；还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
(四) 实验室中克隆质粒的污染
在分子生物实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
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