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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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二、污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染或是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1. 阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2. 阴性对照：每次PCR试验务必做阴性对照，它包括①标本对照：被检标本是血清就用鉴定后的正常血清做对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照；②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。
3. 重复性试验
4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增
三、 防止污染的方法
(一) 合理分隔实验室
将样品的处理、配制PCR反应试剂、循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，试验前应将试验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物，一般选用波长254nm照射30min。
(二) (微量移液器)吸样枪
吸样枪污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸是要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三) 预混和分装PCR试剂
使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外，PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四) 防止操作人员污染
使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
(五) 设立适当的阳性对照和阴性对照
阳性对照以能出现扩增带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反映都应由一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六) 减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止
(七) 选择质量好的Eppendorf管
以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
(八) 使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)
也称为尿嘧啶-N-糖基化酶(UraciI N-glycosylase,UNG)可移除DNA中的尿嘧啶，在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所以在PCR扩增前对新配制的反应物用UDG处理以降解交叉污染的PCR产物，而不降解要扩增的基因组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应。
第四节 PCR技术实验室的质量控制
一、 设备条件
(一) 实验室条件
PCR实验室通常分为四个区，现分述如下：
1. 样品处理区：主要用于样本的处理，如记录、分类等。
2. DNA提取区：该区主要用于样本的DNA提取。
3.  PCR扩增区：该区用于PCR反应的加样和扩增。
4.  检测区：该区主要用于检测PCR的扩增产物。
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(二) 设备条件
1. 样品处理区应具有普通离心机、水浴箱、恒温箱、烤箱等基本设备。
2. DNA提取区的设备主要是台式高速离心机、漩窝振荡器、干热器、反转摇床、恒温水浴箱、磁力搅拌器、潜水式凝胶电泳装置、微量移液器
3. PCR扩增区的主要设备应具有超净工作台、漩涡振荡器、小型台式离心机、20-200μl移液器一套，低温冰柜、冰箱、扩增仪等。
4. 检测区主要有电泳仪、电泳槽(潜水、垂直)，紫外透射仪、干胶系统、图像分析系统等。
二、 人员条件
具备相应理论基础知识和相应操作技能的人员，是开展DNA实验技术的基本条件。实验人员应具备熟练技术操作，正确分析判断试验结果，因此对实验技术人员的要求应当是具备一定的资历，如熟悉生物化学、分子生物学等学科的相关理论和技术，具有一定的实际工作或实验操作经历的专业技术人员。对从事该项技术的人员应定期培训、定期考核。
三、 操作标准问题
1. PCR实验室应有完整的规章制度，包括各类仪器设备的正确使用维护及使用纪录。各类标准实验操作程序。
2. 试验试剂的配置，各类试剂瓶上应标有试剂名称、成份、浓度配制的时间。
3. 设置阴性、阳性对照，以及空白对照。
4. 完整实验纪录，实验纪录应包括实验日期、实验样本、实验操作、实验结果、实验小结。

(景 强)

1  K.B穆里斯,F.费里,K.赫斯等著.聚合酶链式应.北京:科学出版社,1998,第一版.
2  迪芬巴赫,德维克斯勒著.黄培堂等译.PCR技术实验指南.北京:科学出版社,1998,第一版.
3  任新尧,罗超敏,马涧泉主编.分子遗传学与基因工程.河南:河南医科大学出版社,1999,第一版.
4  郑秀芬主编.法医DNA分析.北京:中国人民公安大学出版社,2000,第一版.
5  郭景元,李佰龄主编.中国刑事科学技术大全.法医物证学.北京:中国人民公安大学出版社,2002,第一版.
6  贺林主编.解码生命.北京:化学工业出版社,1999,第一版.
7  林万明.PCR技术操作和应用指南.北京:人民军医出版社,1993,第一版.
8  杨庆恩.DNA在法庭学中的应用.北京:中国人民公安大学出版社,2000,第一版.
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第三章 原位PCR相关技术
第一节 原位PCR
自上世纪50年代初发现DNA双螺旋结构至今，已有无数科学家对如何检测特异的靶序列做了大量工作。原位杂交(in situ hybridization,ISH)是一种常用的分子生物学方法，可定位检测原位基因，具有良好的组织原位定位能力，它的诞生使得靶DNA或RNA的细胞定位成为可能，缺点是敏感性较低。虽然在过去的一段时间里该技术的灵敏度有了极大的改进，尤其是非放射性同位素标记探针的使用使其意义更大，但原位杂交敏感性的高限也只能达到mRNA10~20拷贝/细胞，因此，该技术的应用有一定的局限性。如果细胞中靶片段的拷贝数低于10，原位杂交方法就很难检测出。尽管对特定细胞增殖期病毒DNA的检测不是一个问题，但对晚期病毒感染或点突变的检测就有困难。尤其是在石蜡切片中难以用此方法研究低含量的DNA序列。
1990年由Haase等建立了一种把PCR 和原位杂交结合起来的新方法——原位多聚酶链式反应技术(In Situ PCR,IS-PCR)，简称原位PCR。原位PCR可应用于多种类型的研究材料(组织切片、离心细胞、悬浮细胞等)的不同拷贝数目的序列(病毒的或基因组的DNA或RNA)，扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统也分为直接和间接两种。与其它PCR方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA，即该法在不破坏细胞的前提下利用原位的完整的细胞作为一个微反应体系来扩增细胞内的靶片段并进行检测，从而综合了PCR和原位杂交各自的优点，既有高度的敏感性，又有精确的定位，使得靶基因的检测技术有了极大的飞跃。虽然原位PCR技术刚刚开始，但许多研究小组已相继发表了有关原位PCR技术的数据和手册，目前原位PCR技术已成为靶基因序列的细胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段，广泛用于肿瘤发生学、胚胎学、RNA转录和病毒学检测等方面，该技术具有良好的应用前景。
在上述工作的基础上，1989年，由Koch 等创建了寡核苷酸启动的原位DNA合成技术(oligonucleotide primed in situ synthesis,PRINS)。该技术是通过退火一个寡核苷酸DNA引物到制备在载玻片上的染色体的变性DNA，用掺入的标记核苷酸在原位进行酶促延长并检测的染色体标记技术。此技术的可靠性、敏感性和分辨率较高，现已成为一个替代荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的常规方法。该技术在转移组织和产前诊断中鉴定非整倍体染色体以及人体杂交细胞系染色体分析方面具有不可替代的优势。下面内容主要介绍原位PCR及PRINS技术以及由这两种技术衍生而来的新技术，并对目前常用的有关PCR扩增的细胞内DNA 和mRNA的原位检测技术进行了介绍和比较。
一、原位PCR的基本原理
原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。随着PCR技术的发展，出现了以mRNA为起始物，通过反转录合成靶序列的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测细胞内mRNA靶序列的原位反转录PCR。
原位PCR的大致流程主要包括：(1)染色体、细胞及组织切片样品的制备。此阶段中固定很重要，因为并非所有的固定剂都有利于PCR及原位PCR 反应。(2)PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透，此步既可有利于PCR反应试剂到达靶目标，又可防止扩增后产物漏出，蛋白酶和胰酶是常用的消化膜试剂，不同材料处理的时间和所用酶的浓度有所不同。(3)PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用逆转录PCR。(4)原位杂交及检测。
原位PCR按检测方法不同分为：直接原位PCR；间接原位PCR；原位反转录PCR；原位再生式序列复制反应。
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二、 原位PCR的方法和原则
试剂 ：DEPC处理水、硅化的载玻片、地高辛标记的dUTP、抗地高辛缀合物、常用固定剂(1%～4%多聚甲醛、10%缓冲甲醛液、酒精、丙酮、醋酸/乙醇混合液、Bouin氏液等)、常用酶(蛋白酶、胰酶和用于原位PCR中逆转录过程的无RNA酶的DNA酶)、原位杂交试剂盒(包括蛋白酶、缓冲液、洗液、生色剂、探针和复染剂)RT-PCR试剂盒(包括缓冲液、核苷酸、MgCl2、Taq DNA聚合酶和RT-PCR的对照引物)、原位PCR仪
方法和步骤:
(一) 样品制备
样品保持完好的形态学特征，以利于PCR试剂到达细胞内，尽量减少和避免扩增产物扩散或漏出细胞。
具体操作如下:
1. 用10%甲醛固定组织8～48h，然后用石蜡包埋。
2. 对于培养细胞，用PBS直接清洗培养皿中的细胞一次，加10%甲醛固定液静置过夜，用橡胶刮下细胞，DEPC处理水洗细胞两次，2000r/min离心3min，再用5ml DEPC处理水重悬细胞，吸50µl点在载玻片上。
3. 取几片石蜡组织切片或载有细胞悬液的载玻片，载玻片进行硅化处理。
4. 将组织切片放入新鲜的二甲苯中处理5min，去除石蜡，放入乙醇中浸泡5min后取出凉干。
(二) PCR前处理
1. 蛋白酶消化
胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可使用，胃蛋白酶和胰蛋白酶更好。因为它们比蛋白酶K易失活，在以后的洗涤步骤通过提高pH即可抑制其活性。胃蛋白酶的浓度为2mg/ml其配制过程是：称取20mg胃蛋白酶，加9.5ml水和0.5ml 2mol/L盐酸。
注意：对于原位PCR，蛋白酶消化时间主要取决于甲醛缓冲液的固定时间， (表3-1)列出了两者的对应关系。
载玻片用DEPC水洗1min使蛋白酶失活，再用无水乙醇洗1min，室温干燥。此简单步骤即可去除/灭活蛋白酶，不需加热灭活。
原位PCR对标本处理要求较高，不同固定液、不同固定时间对原位PCR的结果影响很大，固定的温度对原位PCR的结果亦有影响。一般认为，室温或37℃固定24～48h可获得最强信号。固定后的细胞膜起一个半透膜的作用，PCR扩增试剂如引物、dNTPs、缓冲液和Taq DNA聚合酶可穿入细胞和核内，而PCR扩增产物则难以外泄从而能进行原位检测。临床标本以及病理档案的石蜡包埋标本比冰冻切片的处理要复杂一些，这些标本固定的时间一般较长，这可降低细胞的通透性从而减少了PCR产物的扩散，但同时也使足量PCR试剂到达核DNA或胞浆cDNA的可能性降低。因此，除选择合适的消化方案外，应先检查档案样品中核酸保存的完整性。方法是用原位PCR同样的引物做液相PCR，检测该样品提取的DNA或RNA是否有足够的靶DNA/RNA存在。固定后常用蛋白激酶K或胃蛋白酶等对细胞或组织进行轻微的消化，这样可增加细胞的通透性，有利于PCR反应的进行。蛋白酶消化的程度是原位PCR成功的一个关键点。过度消化使扩增的产物漏出致假阳性或假阴性结果，反之则扩增无效。一般而言，简单的固定不需要消化，固定时间越久则需要的消化时间越长，因为此时可能有较多的DNA-蛋白交联形成。不难看出原位PCR样品制备中固定和蛋白酶消化是一对矛盾，关键是找到他们之间的平衡点。
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表(3-1)：10%甲醛缓冲液固定时间对原位PCR过程中不依赖引物信
号的蛋白酶消化时间的影响
固定 时间  蛋白酶a消化时间(分)
   0 5 10 15 30 45 60 75 90
4小时 0 1+ 3+ 2+ 过量消化b 6小时 0 0 1+ 3+ 2+ 过量消化b 8小时 0 0 0 0 1+ 3+ － － －15小时 0 0 0 0 0 1+ 1+ 2+ 3+48小时 0 0 0 0 0 0 1+ 2+ 3+ 1周 0 0 0 0 0 0 1+ 2+ 2～3+c
信号打分方式：0，1+(<25%细胞阳性)，2+(25%～50%细胞阳性)3+(>50%的细胞阳性)，信号检测时不知到反应条件。a.  蛋白酶为胃蛋白酶(2mg/ml),室温消化。b.  过量消化标准指组织形态学丧失同时伴有原位PCR信号丧失。c.  2+信号是用胃蛋白酶消化，3+信号是用蛋白酶K(1mg/ml)消化。

2. DNA酶消化(用于原位PCR中的反转录)
三个组织切片或细胞悬液中的两个用DNA酶消化是必要的，而另一个作为阳性对照切片是不需要DNA酶消化的。大于50%的细胞为强阳性时显示蛋白酶消化时间是理想的；强阳性信号代表DNA修复，基因扩增和错误引导。阴性对照是用DNA酶消化但不经RT处理的细胞或组织切片。信号消失表明DNA酶消化破坏了天然DNA模板，不能进行DNA合成。检测样品是用DNA处理再经RT处理。
步骤：
(1) 取2张切片分别加入：1µl 10×缓冲液(此液由35µl 3mol/L NaAc， 1mol/L MgCl2和60µl DEPC水配制而成)，1µl无RNA酶的DNA酶，8µlDEPC水。
(2) 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防止干燥，将载玻片置于一个37℃的湿容器内。
(3) 过夜消化，除去封条，用DEPC水洗1min，再用无水乙醇洗，室温干燥。
3. 反转录步骤
(1) 取一张经DNA酶消化的切片，加入下列溶液：2µl MgCl2(25mmol/L贮存)， 1µl RT缓冲液，1µl dATP、dCTP、dTTP(每种以10mmol/L贮存)，1.5µl DEPC水，0.5µl 3′端引物(20µmol/L贮存)，0.5µl RNA酶抑制剂，0.5µl反转录酶。这些试剂在RT-PCR试剂盒中均有。
(2) 为了防止干燥，用一小滴指甲油固定住封条，将载玻片放入PCR仪的加热铝板上，盖灭菌矿物油，42℃反应30min。
(3) 除去封条，用二甲苯洗5min除去指甲油，再用无水乙醇洗5min，室温干燥。
(三) 热启动(hot start)
热启动是在进行PCR扩增前先将组织切片与无DNA聚合酶的PCR反应混合液预热至一定温度(55℃～80℃)，然后再加入引物和Taq聚合酶继续进行反应。该过程可明显增强特定靶序列的扩增，降低PCR过程中引物的错误启动，减少非特异性扩增产物。其作用可能是降低引物与细胞内DNA的结合，防止了引物二聚体的形成，从而减少了错误发生率。有研究指出非热启动体系中非特异产物高达50%以上，而热启动后降至1/5000。另一种代替热启动的方法是所谓“化学热启动”，比如将大肠杆菌单链DNA结合蛋白(SS加入PCR反应混合物中，可以抑制错误启动而不影响靶特异性引物退火，增加原位PCR结果的特异性及敏感性。
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(四) PCR扩增细胞内的靶序列
对DNA靶序列的PCR扩增主要由高温变性(94℃×1min)、低温退火(55℃ ×3min)、适温延伸(72℃×2min)三步组成一轮的热循环重复而成。理论上每次循环PCR产物以2n指数递增，经20～25次循环后，PCR产物的积累可达到最大值，可使靶序列扩增106～7倍。但在实际操作中，每步反应率不可能是100%，因此一般循环次数设定为25～30次。过多的循环次数(>30次)之后酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”。
步骤：
1. 每一张载玻片需加25µl溶液：2.5µl PCR缓冲液，4.5µl MgCl2(25mmol/L贮存)，4.0µl dNTP(每种核苷酸终浓度200µmol/L)，1.0µl 2% BSA，0.4µl地高辛标记的dUTP(1mmol/L贮存液), 1.0µl引物1(20µmol/L), 1.0µl引物2(20µmol/L), 11µl水, 0.5U Taq DNA聚合酶。
2. 加入上述25µl溶液到载玻片上，盖上封条，用指甲油固定。
3. PCR仪加热至80℃，加入预热的矿物油，终止程序，升温至94℃，运行PCR程序： 94℃ 1min、55℃ 3min、72℃ 2min25个循环。
4. 去除封条和矿物油，用二甲苯洗5min，乙醇5min，室温干燥。
(五) 细胞内PCR产物的检测
步骤：
1. 用1×SSC溶液(含0.2%BSA)52℃洗载玻片3min.
2. 除去过量的洗液，每张切片加100µl0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和0.1mol/L NaCl溶液(含抗地高辛抗体1：200稀释)。37℃反应30min。
3. 用检测溶液(0.1mol/L Tris-HCI pH9.5和0.1mol/L NaCl)洗切片1min,在检测溶液中孵育切片直到NBT/BCIP生色剂加入。
4. 37℃孵育5～15min，在镜下检查切片，当信号很强时，终止反应。
5. 水洗切片1min后，核用快红复染5min，用水洗1min，无水乙醇洗1min，二甲苯1min，盖上盖玻片在显微镜下观察。
(六) PCR结果的对照实验设计
对原位PCR的每步均应有适当和严格的对照。对照应定性和定量以尽量排
除假阳性和假阴性结果。(见表3-2)

表(3-2)：PCR结果对照实验设计之比较
目的  方法
1、  一般对照检测所用方法的特异性和敏感性检测假阴性和敏感性检测内源性酶的活性检测假阴性DNA/RNA质量检测检测所用定量方法特异性和敏感性2、  细胞悬液检测PCR产物的特异性3、  间接原位PCR检测非特异性探针和抗体附着检测ISH特异性4、  直接原位PCR检测与DNA修复和内源性引物所致的有关的人工假象检测非特异性探针和抗体附着5、  原位逆转录PCR6、  检测错误启动和内源性DNA的扩增  使用已知阳性及阴性的对照样品进行原位PCR用所测试样品抽提DNA/RNA上进行液相PCR在免疫组化中省去一抗内源性对照DNA序列的扩增用不同比例的已知阳性及阴性的细胞混合物作原位PCR，用免疫组化鉴定不同的细胞类型原位PCR后用凝胶电泳和Southern blot杂交分析的细胞胞溶物PCR产物省去DNA聚合酶用与原位杂交无关的探针省去引物省去DNA聚合酶省去逆转录酶/用RNA酶处理样品
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表(3-3)：细胞内DNA和mRNA原位检测技术之比较
  特征  应用  样品  优点  缺点  评述
原位杂交  标记探针对细胞内RNA或DNA的杂交  内源性DNAmRNA或细胞内外DNA/RNA定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备物、染色体制备物  形态学特征好特异性高可用于DNA或RNA、所需设备低廉、同温过程  敏感性较低  催化的显示系统可能明显增加敏感性
原位PCR  对细胞内PCR扩增并通过标记探针杂交或掺入标记核苷酸的免疫学方法对扩增DNA序列的特异性检测  改变的基因或细胞中外来基因的定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品、染色体制备品  同温过程、高度敏感性、可检出单拷贝  设备昂贵、重复性不佳、可造成组织破坏或丢失、定量困难、工作量大  制定标准化操作方案改进显示系统以弥补缺陷
原位逆转录PCR  细胞内mRNA逆转录为cDNA然后进行细胞内PCR扩增和检测  特异性mRNA或细胞中病毒RNA之定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  高度敏感性、可检出极低拷贝信息  除同原位PCR外还需RT-ISH及热循环，能否通过直接掺入的标记核苷酸检测而获得精确结果尚有争议  制定标准化操作方案改进显示系统以弥补缺陷
PRINS  寡核苷酸启动的原位DNA标记反应  中期核扩展和间期核中染色体鉴定及DNA序列图谱、细胞中染色体DNA定位    敏感、快速、非放射性  可能错误启动、特异性取决于一个单引物、可致假阳性  以高的信/噪比检测高拷贝的DNA序列
循环PRINS  同原位PCR           
原位逆转录及RT PRINS  用mRNA互补引物逆转录酶和 dNTP底物在一个细胞内合成标记的 cDNA  细胞中特异性mRNA的鉴定和细胞内定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  比原位杂交更高的敏感性、同温过程、可坚定最小的序列变化  可能错误启动或出现标记核苷酸的非染色特异性  与高活性的显示系统联合可能明显增加敏感性
原位3SR`  同时用三种酶介导cDNA方式的mRNA的同温扩增然后用标记探针做ISH  细胞中特异性mRNA/cDNA的鉴定和定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  同温、无需特殊设备、比原位杂交更高的敏感性  过程复杂、引物在其5ˊ端需RNA启动子序列、扩增后需原位杂交   在存档的石蜡包埋材料中应用此法的经验尚少
（待续）
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三、 原位PCR中的问题和技术难点
原位PCR技术自上世纪90年代初建立至今，科学家就一直对原位PCR的技术和应用进行研究，目前该项技术已日臻完善。原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程以及病理的转归，其特异性和敏感性均高于一般PCR技术。在病毒学、病理学和肿瘤已经成功展示了许多令人瞩目的成就，具有重要的实用价值。但是，任何事物都具有两面性，原位PCR作为一项发展中的新技术，还存在一些问题，在方法上还有待于进一步改进和完善。
(一) 非特异性问题
特异性是评价原位PCR是否成功的一个重要参数。原位PCR的非特异性问题主要是容易出现假阳性结果，包括“细胞内受损DNA的修复而形成的非特异性序列”、“错误启动”、“扩散人工假象”。其错误的原因可能是：①“错误启动”即引物与模板错配或在引物延伸过程中三磷酸核苷酸的错误掺入而导致非特异性序列扩增。导致错误启动的因素包括PCR反应物中寡核苷酸引物的特异性、pH值和Mg2+浓度，以及热循环中的退火温度等，可用热启动或减少冷启动，去除原位PCR中的错误启动。②“扩散人工假象”，即由于特异性扩增产物弥散出细胞外而附着在邻近的阴性细胞上，甚至扩散入该类细胞，导致假阳性信号。据研究发现，若选择最佳通透状况；控制PCR循环次数(少于30次)；在引物延伸时掺入生物素标记的三磷酸核苷酸；在PCR反应中，用针对同一靶序列不同片段的多对引物(5～7对)进行扩增，可得到不同长度的扩增产物，像“脚手架”一样重叠交织一起。由此，可避免扩增产物被洗脱，有利于扩增序列原位保留，防止弥散，使“扩散人工假象”减少。
(二) 敏感性问题
原位PCR是将靶序列扩增后再进行检测，因此提高了在组织细胞原位检出靶序列的敏感性。但与常规液相PCR相比，原位PCR的扩增效率要低得多，这样就会出现假阴性结果。某些常规的固定剂如甲醛有时会导致靶序列与蛋白交联，导致DNA暴露不足，这时可通过适当的蛋白酶、盐酸或加热处理。如何提高病理存档组织、石蜡包埋组织切片原位PCR的敏感性，困难仍就较大，可通过使用多对引物和短的PCR产物的方法来改善，使用相对长的DNA探针或混合寡核苷酸探针也获得了成功，但理论上不排除更多PCR产物停留在原位是由于使用多对引物对，在原位PCR产物中形成了“构架”的缘故，并在检测的清洗过程中不易被洗脱。
四、 应用前景
回首人类文明进步的历程，无数伟大的发明和创造都是以研究方法与工具的创新为先导。原位PCR作为一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的形态学研究方法从一开始就倍受青睐。在检测病毒、原病毒和其他细胞内感染病原体，研究肿瘤发生中的基因变异和对遗传性疾病基因缺陷等方面都发挥了重要作用。原位PCR技术自1990年创立至今已逐渐形成了较完整的体系，有直接法、间接法、反转录法等。在电镜水平进行扩增产物的细胞内定位，原位扩增与免疫组织化学技术相结合，在同一细胞内同时进行DNA和RNA原位扩增以及在染色体带上进行原位扩增等新技术也正在探索之中。随着原位PCR技术的不断改进、完善和发展，其应用必将越来越广泛。可以想象不久的明天原位PCR技术一定会成为分子细胞生物学、分子发育生物学、分子神经生物学、分子病理学、分子遗传学、分子肿瘤学、分子病毒学以及临床各学科在内的科学园地里的重要的研究工具。随着原位PCR的理论和技术逐渐为广大的生物医学科学工作者所掌握，有一天它会真正走出研究实验室，成为诊断实验
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第二节 原位PCR的分类
一、 直接原位PCR
直接法原位PCR是使扩增产物直接携带标记分子，在原位PCR反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物。地高辛-11-dUTP，生物素(荧光素-dUTP)和放射性同位素(3H-CTP)是最常用的三种标记物。当标记物进行PCR扩增时，标记分子就掺入到扩增产物中，可用放射自显影技术、免疫组织化学技术或亲和组织化学等技术检测扩增产物。直接法原位PCR的优点是快速、简便，曾一度被认为可完全代替间接法，但现已证明其结果的特异性不够。即使使用了严格对照的固定、蛋白酶消化和热启动程序，也容易出现许多较强的假阳性信号，严重干扰特异性信号的检测，尤其是在组织切片上进行原位PCR，其扩增效率较低。
直接法原位PCR的假阳性问题在组织切片标本要比完整细胞标本更为严重，原因很可能与标本内受损DNA的修复过程有关。因为固定、包埋及制片过程都会导致DNA损害。而在PCR反应中，受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷酸进行修复。这样，标记物就掺入到DNA的非靶序列中，形成所谓“DNA修复人工假象”。即使反应体系中没有引物，但由于cDNA或DNA片段的非特异性PCR产物引导的所谓“内源性引物” 也会导致这种假阳性出现。此外引物与模板的错配，以及醛类固定可能增加DNA中单链或双链裂缺的数目，也是造成假阳性的一个重要原因。目前认为，设置严格的、适当的对照，谨慎地解释直接原位PCR的实验结果是很重要的。
用标记引物进行直接法原位PCR，其扩增效率要比用不标记引物的低。在应用方面，直接法原位PCR不适于研究内源性基因重排和染色体易位。因为在所有的细胞内都有未重排的靶序列，而引物也会与相应的模板发生特异性结合，并在DNA聚合酶作用下延伸。这样就给基因重排分析带来了困难。
根据目前的文献报道，直接原位PCR不适合用于切片标本。要拓宽直接法原位PCR的应用范围，尚有待于进一步改进技术，以提高其特异性和扩增效率。
二、 间接原位PCR
间接法原位PCR是目前应用最广泛的靶核酸序列原位扩增技术。Haase等于1990年首次报道原位PCR时，用的就是间接法。他们用经固定的细胞悬液做PCR扩增，然后将细胞离心沉淀在玻片上，再对扩增产物进行原位检测。
间接法原位PCR的反应体系与常规PCR相同，所用的引物和三磷酸核苷酸都不带任何标记物。当PCR原位扩增结束后，再用原位杂交技术检测特异性扩增产物。由此可见，间接法原位PCR与原位杂交技术结合，故亦称为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization,简称PISH)。
与直接法原位PCR相比，间接法虽然复杂些，多了原位杂交检测步骤，但它 扩增效率较高，更重要的是特异性比直接法强。理论上说，在靶标记上，介于两引物间的区域的探针的特异性是最完美的，而原位杂交所用的探针符合这一标准，可特异性地检出扩增产物中的靶序列。这样，即使扩增产物中有非靶序列成分，它们也不会呈现阳性反应，因而提高了原位PCR的特异性。
原位杂交的方法很多，原则上都可用于结合PCR技术。但还是以非同位素标记物，如地高辛、生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交较为常用。
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三、 原位反转录PCR
原位反转录PCR(in situ reverse transciption PCR,简称In Situ RT-PCR)是结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法。全过程分两步进行。
第一步以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA。第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增。与液相反转录PCR不同的是，原位反转录PCR反应过程在固定的组织细胞标本上进行。进行原位反转录PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA。这样可保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。处理时可将150～300µl不含RNA酶的DNA酶滴加在标本上，再剪一块比标本略大的蜡膜轻轻地覆盖在液滴上。注意将蜡膜的清洁面向着标本。然后切片置于湿盒内，室温下孵育过夜。处理结束后，标本用PBS洗涤5min。如果PCR扩增的引物与细胞本身的基因DNA相距甚远，残留在细胞中DNA就不会被扩增。在这种情况下，标本则可不必用DNA酶处理。第一步反转录反应一般在42℃下进行30～60min。此时，在有逆转录酶、随机六聚物(random hexamer )和游离核苷酸存在的条件下，以mRNA为模板合成cDNA。反转录反应结束后，可将标本加热至90℃以上，以灭活逆转录酶，或用PBS洗涤5min，将逆转录酶洗去，接着以cDNA为模板进行第二步PCR扩增。
1991年Cetus公司推出了一种新酶，rTth逆转录酶。它的特点是具有很强的分别依赖RNA和DNA聚合酶活性。利用rTth酶，就可使原位反转录PCR上述的两个步骤用一种酶在一个条件下完成，简化了操作，缩短了实验时间。

第三节 原位PCR技术
一、 直接原位单拷贝PCR
在原位PCR未问世以前，中期染色体DNA标记的原位荧光杂交(FISH)等方法曾被有效地用于功能基因的物理绘图和了解高等生物的基因组成。但FISH方法不够敏感，检测长度小于3~5kb的序列很困难。目前已用原位PCR等方法直接在中期染色体上检测短序列，其中寡核苷酸启动原位合成(PRINS)系将一个寡核苷酸退火到一个变性的染色体上，然后经DNA聚合酶原位延长并标记，这是一个检测低拷贝序列的有效方法。直接原位单拷贝PCR(DISC-PCR)技术用两个引物对直接制备在载玻片上的中期染色体进行PCR反应以确认所研究的序列，将一个半抗原核苷酸如生物素-16-UTP掺入PCR扩增产物中，加入链霉素抗生物素一信号酶与适当底物，就会在放大位点上产生有色沉淀。
DISC-PCR不需要手边有克隆的基因，只要有合成PCR引物足够的序列资料即可用于定位哺乳动物染色体上100~300bp的短序列，它特别适合于序列界标(STS)的物理定位，也可以用于绘制表达序列标记(ESTs)。目前其最大的不便是完成程序之后分带比较困难，而且必须分析数目庞大的中期分离染色体。
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