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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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(一) 试剂和材料
1．淋巴细胞的培养和中期染色体的制备部分
(1) PBS。
(2) KCM培养液：
20mmol/L NaCl，
120mmol/L KCL，
0.1%TritonX-100，
10mmol/L Tris-HCl pH8.0。
(3) RPMA-1640  培养液。
(4) 乙酰甲基秋水仙碱储存液：10μg/ml水溶液，滤过消毒。

(5) 0.3%谷氨酰胺储存液。
胎牛血清(FCS)。
(7) Lymphopaque。
脂多糖。
(9) 培养(细胞)计数器。
(10) 细胞离心机。
(11) CO2孵箱。
2. 直接原位单拷贝PCR(DISC-PCR)部分
(1) 10mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
(2) 5mmol/L生物素-16-dUTP。
(3) 寡核苷酸引物可在ABI DNA合成器上合成。除了常规乙醇沉淀和洗涤，不需要进一步纯化即可直接使用，浓度为20μmol/L。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10×Taq 聚合酶缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2，0.1%BSA。
显微镜载玻片和20mm×50mm 盖玻片，浸泡在无水乙醇中，在用滴加法分离中期染色体前用软布擦干净。
(7) 橡皮粘胶。
3. 信号检测部分
(1) 20×SSC。
(2) PBS缓冲液调pH值到7.4。
(3) 工作缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.2% Tween，0.3% Triton。
(4) 阻断缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.5%阻断剂(BMB Genius Kit)，配制时，先配Tris - NaCl液，后加阻断剂搅拌到至溶解，约需1h。
(5) 链霉素抗生物素辣根过氧化物酶，1mg/ml。
快红。
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发表于 2011-8-24 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
(7) 四甲基联苯胺(TM。
(二) 操作方法和步骤
1. 从小鼠脾细胞中培养淋巴细胞
(1) 处死小鼠，取出脾脏。
(2) 将脾脏放入培养皿中，用25号针吸5ml RPMI培养液，加压冲洗脾细胞2次，135g 离心洗出液10min, 收集沉淀，重悬于2ml RPMI-1640 培养液中。
(3) 加3ml PBS到细胞悬液中，在微离心管内加3ml Lymphopaque,然后将细胞悬液加在Lymphopaque 上，911g 室温下离心20min,可见一清晰条带。
(4) 用细移液管取出淋巴细胞，用含15%FCS和0.03%谷氨酰胺的RPMI-1640培养液洗细胞。
(5) 低转速沉淀细胞[同第(3)步]，重悬于10ml RPMI-1640 培养液中，计数细胞。
以106/ml的密度，用含有0.03%谷氨酰胺和15%FCS的RPMI-1640培养液培育10ml细胞，在37℃下培养72h, 然后以0.25mg/ml浓度加入脂多糖，刺激细胞生长。(在培养皿表面分开的淋巴细胞生长为细胞柱，这些细胞柱的数目是衡量培养好坏的指征)。
2. 人血淋巴细胞的培养
(1) 用消毒玻璃棒去掉血中纤维蛋白。
(2) 用5~10ml PBS稀释10~20ml 去纤维蛋白血液，然后加3.5ml在Lymphopaque上，911g室温下离心20min,可见一清晰条带。见“(二)操作方法和步骤同1(3)~”步吸取淋巴细胞及培养细胞。
3. 用标准技术制备中期染色体
(1) 在培养液中加终浓度为0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱培养1~2h。
(2) 手掌拍打培养瓶侧面使贴壁细胞脱落，135g离心10min收集细胞。真空吸去上清液。
(3) 重悬细胞于约10ml低张溶液(如75mmol/L KCl)中，37℃孵育10min或室温2min。
(4) 用血细胞计数器检测低张溶液中细胞的浓度，用Ames Cyto-Tek细胞离心机制备中期染色体的最佳细胞浓度是(1~2)×105/ml。用低张KCl稀释校正标本浓度。
(5) 将准确体积的标本加样于用乙醇清洗过的玻片上，用2500g离心10min。
在相差显微镜下检查初次展开的细胞的浓度是否需要校正。可以通过调节2~3个浓度参数去获得最佳分离效果。
注：如细胞浓度太高细胞散离差，形成稠密堆积；细胞浓度过低引起中期染色体展开或拉长。
(7) 用吸水纸吸去细胞边缘多余的液体，在空气中放置2min，然后放入一装有KCM培养液的广口瓶中室温下10min。
4. DISC-PCR
(1) 在PBS中洗10min, 在70%、80%、95%、100%乙醇中梯度脱水各5min。
(2)在微离心管中准备如下溶液(每张标本) dATP，dCTP，dGTP各200μmol/L；100μmol/L dTTP；100μmol/L生物素-16-dUTP；1.5μmol/L引物；2.0μl 10×Taq缓冲液；2.5U Tap聚合酶和去离子水20μl。
(3) 将以上反应混合液加在有中期染色体的载玻片上，盖上盖玻片。用橡皮粘胶封固盖玻片四周。
(4) 室温空气干燥橡皮粘胶，载片边缘涂上一层指甲油。
(5) 按以下热循环程序孵育标本 94℃ 3min→退火温度1min→ 72℃ 1min→92℃ 1min , 循环24次(总25次)，最后延长3~5min。
用软纸擦去指甲油，在100%乙醇中提插几次玻片，揭去橡皮粘胶，轻轻的去掉盖玻片(从此步开始应小心不能让标本干，但可用滤纸吸去玻片边缘多余液体)。
(7) 立即将标本浸入4×SSC中3min,然后浸入阻断缓冲液中1h。
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5. 信号检测
(1) 从阻断缓冲液中取出标本，轻轻甩去多余液体，每片加100μl用工作缓冲液按1 ：100稀释的链霉抗生物素辣根过氧化物酶(如果出现背景问题，减少链霉素抗生物素偶联辣根过氧化物酶浓度或(和)增加洗涤时间)。
(2) 盖上盖玻片，湿盒中37℃孵育1h。
(3) 室温下用工作缓冲液洗10min, 再用0.1mlo/L Tris-HCl pH7.6 洗5min。
(4) 加100μl TMB, 盖上盖玻片，室温下1~2min(可呈现蓝色信号)。
(5) 用去离子水洗5min。
用快红复染5min, 流水冲洗。
(7) 梯度乙醇脱水(40%、70%、80%、95%)各5min。
常规方法封片。
(9) 用差相显微镜读片。
二、 在细胞和石蜡切片上检测低拷贝DNA序列的原位PCR方法
原位PCR技术综合了原位杂交和液相PCR技术的优点，成为在细胞和组织切片内检测低拷贝数目RNA或DNA的一个敏感的方法。虽然存在重复性不够
好和假阳性等问题，但这种技术正广泛地应用于病毒病原体研究等多个领域。
本文介绍一种在培养细胞和组织切片上检测单拷贝人巨细胞病毒(CMV)和人乳头瘤病毒(HPV)核酸序列的原位PCR操作方案。本方案强调直接和间接原位PCR的严格的标准化步骤。
重点是：①不同材料(载玻片上培养的HeLa细胞、石蜡包埋组织、微孔板上培养的MRC5细胞等)的制备；②适当的固定时间、蛋白酶水解消化时的酶浓度和消化时间；③寡核苷酸引物的选择；④PCR溶液中各种不同试剂的最适浓度；⑤选择反应的热循环参数。
(一)试剂和材料
1. 聚-L-赖氨酸包被的载玻片制备部分

(1) 去离子水。
(2) 洗涤剂。
(3) 乙醚。
(4) 无水乙醇。
(5) 聚—L—赖氨酸氢溴化物。
Triton X-100。
(7) 1mol/L Tris-HCl pH8.0。
26mm×76mm载玻片。
(9) 玻璃染皿。
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(10) 60℃烤炉。

2. 石蜡包埋组织部分

(1) 石蜡。
(2) 37％甲醛固定液。
(3) Na2HP04，KH2P04。
(4) 80％、95％和100％乙醇
(5) 二甲苯。
自动固定器。
(7) 铜包埋盒

3. 组织切片制备部分
(1) 0.1mol/L Tris-HCI pH7.4。
(2) 0.1%胶水(用去离子水稀释纯白胶)。
(3) 吸水纸。
(4) 切片机及刀片。
4. 培养细胞部分

(1) HeLa细胞(ATCC)。
(2) MRC5细胞(ATCC)。
(3) EMEM培养液。
(4) RPMI-1640培养液。
(5) 5％或10％胎牛血清(FCS)。
PBS。
(7) 二甲基亚砜DMSO。
地塞米松。
(9) 庆大霉素。
(10) 非必需氨基酸。
(11) 1％和2％甲醛缓冲液。
(12) 巨细胞病毒种属AD169(ATCC)。
(13) 冰预冷丙酮。
(14) 10cmPetri培养皿。
(15) 聚-L-赖氨酸包被的载玻片。
(16) 96孔组织培养板。
(17) 湿盒。
(18) 低速离心机。
(19) 玻璃染缸。
(20) 组织培养层流工作台。
5. 蛋白水解消化，病毒DNA变性和原位PCR部分
(1) 蛋白酶K，分装后存于一20℃。
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(2) 100mmol/LdNTPs溶液。
(3) 0.1mo1/LTris-HCl，pH8.0。
(4) 10mmo1/L EDTA。
(5) 10×Taq平衡液 100mmol/L Tris-HCl pH8.5，500mmo1/L KCl，50mmo1/L MgCl2(为进行HPV分析)，25mmo1/L MgCl2(为CMV分析)，0.1％明胶，0.5％Tween-20，0.5％Nonidet P40。
0.4mmo1/L生物素-14-dATP溶液。
(7) 寡核苷酸引物(表3-4)由Genset合成，纯化，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查。
TaqDNA聚合酶。
(9) 22mm×22mm盖玻片。
(10) 橡皮粘胶。
(11) PCR机。
6. 放大产物的检测部分
(1) PBS 0.1mol/L。
(2) Tris-HCl，pH7.4。
(3) 20×SSC 3mo1/L NaCl，0.3mo1/L柠檬酸三钠 pH7.5。
(4) 四唑氮蓝(NBT)，5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(BCIP)。
(5) 碱性磷酸酶抗生物素。
100％乙醇。
(7) 缓冲液A (存于－20℃)
组成 ： 0.02mo1/L NaH2P04
0.08mo1/L Na2HPO4
0.1mo1/L NaCl，5％BSA
0.5％TritonX-100
缓冲液B (存于4℃)
组成 ： 1mol/L Tris-HCl pH9.6
0.1mo1/L NaCl
50mmol/L MgCl2
(9) 为检测HPV，CMV，HIV的生物素化的探针。
(10) 去离子甲酰胺 混合500ml甲酰胺和50g离子交换树脂(AG501-X8 CD)，10g活性碳，在4℃搅拌过夜，用滤纸过滤，5m1分装，储存于－20℃。
(11) 硫酸右旋糖酐：加100g硫酸右旋糖酐于100ml去离子水中，加热到60℃使其溶解，2m1分装，储存于－80℃。
(12) 鲑鱼精子DNA(10mg/m1) 用去离子水1：10稀释，250µl分装，存于－80℃。
(13) 水溶性封片液。
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(14) 37℃和40℃烤炉。
(15) 小刀片。
(16) 光学显微镜和倒置显微镜。

表(3-4)：原位PCR中所用的寡核苷酸引物序列
名 称  来 源  序 列
MY11  上游引物,位于HPV6/6722-6741(41)  5'GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG3'
MY09  下游引物,位于HPV6/7170-7151(41)  5’CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC3’  
IE1  上游引物(41)  5’CCA CCC GTG GRG CCA GCT CC3’
IR2  下游引物(42)  5'CCC GCT CCT CCT GAG CAC CC3'
GAPDH1  上游引物  5'ATC ACC ATC TTC CAG GAG CG3'
GAPDH2  下游引物  5'CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3’
(二)操作方法和步骤
1. 聚-L-赖氨酸包被载玻片的制备
载玻片的处理和处理后放置的时间对成功的原位PCR是很重要的。干净的聚-L-赖氨酸包被的载玻片可使细胞和石蜡包埋的组织切片很好地贴附而无任何背景。要获得最好效果，载玻片应在使用前制备，不得早于1～2周。
(1) 0.05%多聚-L-赖氨酸氢溴化物溶液：在2L含200µl TritonX-100的
0.1mo1/L Tris-HCl pH8.0溶液中溶解100mg多聚-L-赖氨酸。贮存于4℃，如出现云雾状应弃去。
(2) 载玻片用洗涤剂清洗后用流水冲洗，浸入去离子水中浸洗2次，每次不少于10min。然后浸入无水乙醇中浸洗2次，每次10min，再浸入1:1 100%乙醇和乙醚的混合液中10min,取出室温干燥。
(3) 室温下用多聚-赖氨酸溶液浸泡载玻片20min后用吸水纸吸干多余液体在60℃烤箱中烤干1h。
(4) 室温存放于片盒中。
2. 石蜡包埋组织的制备
(1) 制备1％甲醛缓冲溶液 用0.1mol/L Na2HPO4, 0.04mol/L KH2P04 pH7.2溶液将40％的甲醛稀释为1％。
(2) 细胞和组织的固定对原位PCR的效果有很大影响。用甲醛固定对此方案较适合，可提供很好的渗透性并使PCR试剂达到目标序列，并可形成一个物理的屏障防止PCR产物的扩散。用同样方法固定培养在载玻片上的HeLa细胞。培养在微孔板上MRC5细胞，用2％甲醛缓冲液和乙醇／丙酮的混合液固定20min，可产生PCR产物的最好检测效果。将组织块浸入1％甲醛缓冲溶液中一定时间，根据不同组织，固定时间在20 min～24h之间,一般组织固定12h以上适合于扩增。
(3) 在梯度乙醇中脱水 2×80％、2×95％、1×100％，各30min。
(4) 在二甲苯中孵育3次，每次60min。
(5) 石蜡包埋 在60℃石蜡中浸蜡1h后，将组织块放入预热的铜包埋盒中进行常规包埋。
3. 组织切片的制备
(1) 切4～10µm厚的带状连续切片。在每一组织块切后清洁刀片，防止标本间的污染。
(2) 在每一预处理过的载玻片上滴1滴胶水。
(3) 每一载玻片上放2张切片于胶水上，并用小刷子铺展开。
(4) 将载玻片放在45℃热板上。
(5) 在切片完全铺好后，从热板上取下载玻片，并用吸水纸吸干多余胶水。
在60℃烤炉中烤切片90min，然后在20℃中晾24h，装入载玻片盒存于室温。切片在制备后12h内不得使用。
(7) 将切片放在60℃热板上5min，然后在二甲苯中脱蜡3×5min。
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在2×100％、2×95％、2×80％的梯度乙醇中依次水化，每次5min。
(9) 在0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4中浸泡5min(此步以后任何时候不应让切片干)。
4．HeLa培养细胞的制备
(1) 在每一个10cm×10cm培养皿中放5张预处理过的载玻片。
(2) 将HeLa细胞以106/m1的浓度重悬于30ml含有10％胎牛血清, 1％非必需氨基酸和56mg／L浓度的庆大霉素的EMEM培养液中，加入准备好的培养皿中。37℃ 5％CO2的孵箱中孵育24h。
(3) 将载玻片放入有1％甲醛缓冲液中22℃固定12h。吸干多余液体，在22℃干燥1h。如固定时间<12h，扩增效果和分辨率降低。
(4) 在2×100％、2×95％、2×80％的梯度乙醇中依次水化，每次5min。
(5) 在0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4中浸洗5min(此步以后在任何时候不应让切片干掉)。
5．MRC5细胞的制备
(1) 重悬MRC5细胞在含有5％FCS和56mg/L庆大霉素的RPMI－1640培养液中，以每孔1.5×104/200µl的浓度计算并种植于96孔板上， 在37℃ 5％CO2孵箱中孵育48h。
(2) 吸去培养液，每孔加200µl含有0.1％地塞米松和1％DMSO的用RPMI稀释的血液白细胞。
(3) 在30℃、200g离心1h以增加病毒感染力。
(4) 吸去上清，每孔加200µl含有10％FCS，0.1％地塞米松和1％DMSO的RPMI，以增加病毒复制。在37℃，5％CO2的条件下孵育16h。
(5) 用PBS洗2次。
用2％甲醛缓冲液室温下固定20h, 然后在4℃的冷乙醇:丙酮(90：1)的混合液中固定20h。
(7) 从以上固定液中取出便可用于原位PCR。
设置特异性的阳性对照 用CM—VADl69感染的MRCS细胞，平行做原位PCR。
6．原位PCR
(1) 蛋白酶水解消化 (酶浓度越低其渗透性越差，浓度过高会损伤组织，消化时间在20min以上会导致扩增产物丢失。对微孔板培养的MRC5细胞，由于不须保存细胞形态，故蛋白水解消化一步可省略)。
1) 用预热的稀释在0.1mo1/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L EDTA中的蛋白酶K(组织切片浓度为10µg/m1，制备在载玻片上的HeLa细胞用20µg/m1)孵育载玻片上固定好了的组织切片和细胞，37℃，20min。在PCR机内95℃孵育标本2min使蛋白酶K失活。
2) 用0.1mol/L Tris-HCl pH7.4洗2×5min。
(2) 组织切片和HeLa细胞上病毒DNA的变性
1) 在标本上加100µl 1×Taq缓冲液，用盖玻片覆盖，并检查有无气泡。
2) 在PCR机上95℃孵育5min，然后放在冰上。轻轻揭开盖玻片，甩掉表面的液体。
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3) 制备扩增混合液：2.5µl 10×Taq缓冲液，终浓度为200µmol/L的四种dNTPs，(在直接原位PCR中，dATP中含有100µmol/L生物素—14--dATP和100µmol/L未标记dATP)，二种引物MY09－MYll终浓度各100µmol，3.5UTaq聚合酶，去离子水加至30µl。
(3) MRC5细胞上病毒DNA的变性
1) 在微孔板的每个小孔中加20µl的1×Taq缓冲液，用蜡膜覆盖微孔板。
2) 在200g下离心10s以使平衡液分布均匀。
3) 扩增混合液中，除引物为每孔50µmol的IEl和IE2及聚合酶为1U/孔外，其它均与(2)，1)一样。
(4) 直接原位PCR
1) 在每张载玻片上或微孔中放30µl扩增混合液。
2) 用盖玻片覆盖标本，并用橡皮粘胶封固盖玻片边缘；用1cm×lcm大小的蜡膜覆盖每个微孔，再用一张大的蜡膜覆盖整块微孔板，以防止蒸发。
3) 按以下程序完成原位PCR。对人乳头瘤病毒：95℃ 60s变性，57℃ 90s退火，74℃ 90s延伸20个循环，然后74℃ 3min再延伸1次，30℃10s终止反应。对HeLa细胞和组织切片，按以上程序15～20次循环后即可得到最佳信号。对CMV DNA：95℃ 60s变性，55℃ 60s退火和延伸× 20次循环。
注：对HPV和CMV DNA的扩增，时间和温度应根据其使用的PCR扩增仪来优化。最佳退火温度根据每种寡核苷酸引物来确定。热循环次数可参照液相PCR，次数太少则信号不足；次数太多则背景增高，并可损伤组织和损失信号。
(5) 间接原位PCR 在这个实验中，扩增混合液中仅含未标记dNTP，其它程序均与直接原位PCR相同。
7. 组织切片和HeLa细胞直接原位PCR扩增产物的检测
(1) 用小刀揭去盖玻片，并用刀片刮掉橡皮粘胶。在0.1mol/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(2) 在冰预冷的100％乙醇中固定10min。
(3) 80％乙醇中水化5min后用0.1moI/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(4) 每个标本加100µl 用缓冲液A以1：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
(5) 用1×PBS洗2×5min。
用缓冲液B以0.33mg/m1浓度稀释NBT和以0.16mg/ml浓度稀释BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
(7) 暗室中，室温孵育1～3h。
去离子水中洗2× 5min终止反应，然后室温晾干。
(9) 用水溶性封片液封片，光镜检查。在阳性细胞中可发现棕紫色信号。
(10) 直接原位PCR在获得最佳效果时，比间接原位PCR的非特异性信号少。
8. MRC5细胞直接原位PCR扩增产物的检测
(1) 去掉蜡膜，小心地吸去PCR反应液。
(2) 用0.1mol/L Tris-HCl pH7.2，洗2×5min。
(3) 将微孔板浸入100％乙醇中固定10min。
(4) 80％乙醇中水化5min后用0.1mol/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(5) 每个标本加100µl用缓冲液A以1：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
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发表于 2011-8-24 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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用1×PBS洗2×5min。
(7) 用缓冲液B以0.33mg/m1浓度稀释NBT和以0.16mg/ml浓度稀释BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
暗室中，室温孵育1～3h。
(9) 严密监测颜色生成，然后用去离子水洗2×5min终止反应。 ·
(10) 每孔加100µl去离子水防止细胞干燥，在倒置显微镜下观察结果。
9. 间接原位PCR扩增产物的检测
(1) 用小刀揭去盖玻片，并用刀片刮掉橡皮粘胶，或去掉蜡膜。
(2) 在0.1mol/L Tris-HClpH7.4，洗2×5min。
(3) 在冰预冷的100％乙醇中固定10min。
(4) 80％乙醇中水化5min后用0.1moI/L Tris-HClpH7.4，洗2×5min。
(5) 每份杂交缓冲液中含2×SSC，50％去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，250µg/m1鲑鱼精子DNA，和5ng探针，共20µl，加在载玻片上或小孔中，用盖玻片覆盖。
在96℃水浴中变性靶DNA和探针DNA 5min。
(7) 湿盒中42℃原位杂交过夜。
将载玻片浸入4×SSC中室温下1～2min可使盖玻片脱落。
(9) 用2×SSC室温下洗3～5min，然后在42℃的2×SSC，0.5×SSC，和0.1×SSC中各洗5min。
(10) 每个标本加100µl用缓冲液A以l：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
(11) 用1×PBS洗2×5min。
(12) 用缓冲液B以0.33mg/ml浓度稀释NBT和以0.16mg/m1浓度稀释 BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
(13) 暗室中，室温孵育1～3h。
(14) 去离子水冲洗2×5min终止反应，然后室温晾干。
(15) 用水溶性封片液封片，光镜检查；或每孔加100µl去离子水防止细胞干燥，在倒置显微镜下观察结果。在阳性细胞中可发现棕紫色信号。
三、 冰冻切片上的逆转录原位PCR
PCR是实验室常用的一种高敏感的技术，应用于扩增低拷贝或单拷贝基因序列。通过与其它多种方法相结合，PCR已从单一液相的DNA、mRNA的放大和检测发展为对组织切片上靶目标的信号的原位PCR技术。与原位杂交相比，原位PCR的敏感性要高出几个数量级。
本文介绍在冰冻切片上的原位逆转录PCR(1S—RT—PCR)：在载有冰冻切片的载玻片上直接放大感兴趣的片段，将地高辛、生物素或放射物质标记的核苷酸结合到放大产物中，并用抗体或放射自显影进行检测。本方法适用于各种型号的载玻片，可以在3mm×3mm大小的组织切片和可放入500µg的薄壁PCR管中，在小的载玻片上进行标准的PCR反应。
本方法的要点是：
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发表于 2011-8-24 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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第一、设计针对目的核酸序列的特异寡核苷酸引物对。
第二、原位PCR可检测单个细胞中的基因组DNA或mRNA片段。反应过程中胞浆mRNA首先丧失或降解，逆转录酶或寡核苷酸引物难以和胞浆中低水平的mRNA形成足够量的结合，除了当被检测的细胞过度表达目的mRNA外，可检测出的大多是核的DNA或其它mRNA的阳性反应。
第三、更多的循环导致特异性降低和背景增强。如果检测组织或细胞中存在病毒DNA的单拷贝(如对HIV的分析)，可以通过增加热循环次数来适当的提高分析的灵敏度。在这种情况下本方法中将循环次数设定在7～10次。这样可不用DNA酶和RNA酶，而背景不会增加，因为没有基因组DNA去竞争。但是，实验必须用未感染组织作对照。
第四、原位PCR分析敏感性高，在组织切片上进行PCR反应可能带来诸如非特异性扩增；内源性启动合成；DNA修复人工假象的扩增；扩增产物相互融合以及检测出基因组DNA而不是mRNA等一些问题。通过仔细的预实验和严格的对照可以避免或减少以上问题发生。
第五、通过充分洗涤减少假阳性反应和背景。需预实验摸索扩增中的最佳解链和延伸温度、Mg2+离子浓度和pH值。
第六、本方法已成功检测EGF受体、人和鼠的PDGF、TGF－α、TGF－β、flil，H.ras和P53等。某些同源序列存在于交叉种类中，例如在EGF受体中，同样的引物已被用于特异的检测人类、猫科动物、鼠类、和兔的受体。
(一) 试剂和材料  
所有的溶液均用高压消毒的去离子水配制；每月至少检修一次微加样器，用超声波和肥皂清洗并校准；所有操作时带手套均用消毒微加样器头；保持环境清洁。
1. 组织制备
(1) ProbeOn P1us载玻片(Fisher) 与其它载玻片比较，在这种载玻片上组织和细胞贴附最好且背景最小。
(2) 异丙醇(存于－20℃)。
(3) 去离子水。
(4) PBS-DIFP(洗液) PBS+0.1pmo1/L DIFP(注：凡含DIFP的溶液应在其使用前现配)。
(5) 0.1mmol/L DIFP(Dlisopropyflu—orophosphate)溶于异丙醇中,－20℃。
10％甲醛缓冲液。
(7) 3％多聚甲醛缓冲液(新鲜配制):100mmo1/磷酸钠pH7.4 5mmol/L MgCl2，3％多聚甲醛。
10％Nonidet P-40按0.1％浓度，稀释于PBS中使用。
(9)10×DNA酶缓冲液 0.4mo1/L Tris-HCl pH7.9,100mmol/L NaCl，60mmo1/L MgCl2。
(10) RQI无RNA酶的DNA酶。
(11) 1mg/m1蛋白酶K 溶于2mmo1/L CaCl2，20mmol/L Tris-HCl pH7.5，工作液浓度为10µg/m1。
(12) 2mg/m1胰蛋白酶原，溶于0.01N HCl中。中和液：0.1mo1/L Tris-HCl pH7.0，0.1mol/L NaCl，0.1µmo1/L DIFP。
(13) RNasin。
(14) 湿盒(在作ISH时应用一个可以保持湿润的塑料盒子)
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