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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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2. 逆转录
(1) 2.5mmo1/L dNTPs。
(2) 10µmo1/L寡核苷酸引物。
(3) RT酶 M-MLTV(Gibco)。MV和M-MLTVRT酶的最佳反应温度在37～42℃之间，推荐时间为1h，这种耐热的RT酶将用RNA或DNA作为底物。为了增加寡核苷酸引物结合到mRNA上的特异性，反应温度可增至50℃。
(4) 10mmol/L DTT。
(5) 5×RT缓冲液 50mmol/L Tris-HCl pH8.3，250mmo1/L KCl，7.5mmo1/L MgCl2。
盖玻片。
(7) RNasin。
3. PCR扩增
(1) 用重层铝板覆盖的PCR机。
(2) 橡皮粘胶。
(3) 20×SSC 3mmo1/L NaCl，300mmol/L柠檬酸三钠。
(4) 10×Taq聚合酶缓冲液 100mmo1/L Tris-HCl pH8.3， 500mmol/L KCl , 15mmo1/L MgCl2。
(5) 50mmo1/L MgCl2。
2.5mmo1/L dNTPs。
(7) Taq I DNA聚合酶。
10µmo1/L 5′和3′端寡核苷酸引物对。
(9) 2.5µmo1/L地高辛-11-dUTP。
4. 免疫检测
(1) 10％TritonX-100。
(2) 顺丁烯二酸盐缓冲液 100mmol/L顺丁烯二酸，150mmo1/L NaCl pH7.5。
(3) Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液 0.3％Triton X-100稀释于顺丁烯二酸盐缓冲液中。
(4) 4％绵羊血清 用Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液稀释。
(5) Fab-抗地高辛-碱性磷酸酶 1:500比例稀释在4％绵羊血清-Triton-maleate中。
NBT(色原)缓冲液 100mmo1/L Tris-HCl pH9.5，100mmo1/L NaCl，50mmo1/L MgCl2。
(7) 四唑氮蓝(NBT)。
5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(X-磷酸盐)。
(9) Levamisole(Sigma)。
(10) NBT染液 45µl NBT，35µl X—磷酸盐，加入0.24mg levamisole/m1的色原缓冲液中，配好后立即使用，用铝膜覆盖试管口存于4℃。
(11) TBE缓冲液 l0mmol/L Tris-HCl pH8.0，lmmol/L EDTA。
(12) 75％、95％和100％乙醇。
(13) 二甲苯。
(14) 盖玻片。
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(二) 操作方法和步骤
1. 组织制备
(1) 用常规方法制备组织冰冻块，修成约1cm3大小，切片后置于ProbeOn Plus载玻片中央。
(2) 用10％甲醛缓冲液或3％多聚甲醛室温下固定10min。
(3) 用PBS-DIFP洗3×5min。再用去离子水洗1次。
(4) 在切片上加100µl 0.1％ NP-40或胰蛋白酶原或蛋白酶K
注:尚无标准的方法去除粘附在核酸上的结合蛋白质。本步骤是否必要，完全根据所要扩增的RNA／DNA片段决定。恰当的处理可获得最佳形态学图像。消化处理应根据不同组织和固定的条件而定。用0.1％NP-40孵育30min是非常温和的消化，用胰蛋白酶原或蛋白酶K消化10min产生的结果很差。
(5) 用PBS-DIFP洗5min。
在标本上加l00µl含有8U DNA酶和75U RNasin的DNA缓冲液，并用盖玻片覆盖，湿盒中37℃孵育30min。
(7) 浸入PBS中，去掉盖玻片，然后放入－20℃预冷的异丙醇中30min终止反应并固定，再用PBS洗3×5min。
2. 逆转录
(1) 在标本上加l00µl含有400U逆转录酶，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，四种dNTPs各2.5µmol/L，0.1µmol/L 引物或0.12µmol/L寡核苷酸d(T)15的RT缓冲液。
(2) 盖上盖玻片，湿盒中50℃孵育30min。然后将标本浸入1×SSC中，去掉盖玻片，95℃水浴中孵育5min终止反应。
(3) 用1×SSC洗3×5min，然后用去离子水洗2×5min。
(4) 室温下自然干燥。
3. PCR扩增
(1) 在标本上放60µl反应混合物（l×Taq缓冲液中含有0.25U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，四种dNTPs各2.5µmol/L，0.125gmol/L 地高辛-11-dUTP，0.1µmol引物），去离子水加到70µl。
(2) 盖上盖玻片，再用橡皮粘胶封固盖玻片边缘。
(3) 将标本置于PCR机内，92℃预热5min。
(4) 变性92℃ 1 min，退火60℃ l min，延伸72℃l min，7～10个循环后，72℃保持10min。
注：放在PCR机上面的载玻片，在设定的温度达到之前有约lmin的间歇。根据不同的引物，PCR反应条件不一。在大多数反应中，完成7～8个循环足以获得好的结果。其反应温度和时间完全根据PCR机的型号而定。
(5) 扩增产物冷却到室温，浸入2×SSC中去掉盖玻片，用2×SSC洗2×5min，1×SSC洗2×5min，5×SSC洗1×5min。
4. 免疫检测
(1) 用含4％绵羊血清的Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液预孵育标本2×15min。此间持续晃动。
(2) 用移液器吸去4％绵羊血清的Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液。
(3) 将100µl Fab'-抗地高辛素滴放在标本上，盖上盖玻片，湿盒内室温下孵育至少3h。
(4) 用Triton-顺丁烯二酸盐洗5×5 min。
(5) 用NBT缓冲液预孵育2×5min。
去掉NBT缓冲液，每张标本上加l00µl NBT染液，室温下湿盒内孵育5min。
注：加NBT染液应仔细控制反应时间。染液浓度明显影响染色时间。对每一批新的染液，其条件可能明显地不一样。反应的灵敏度需要在预实验时通过试验确定。如果mRNA丰度低，就用一个低丰度的对照实验去检测其染色时间。推荐使用BoehrimgerMan-nheim所生产的试剂，染色5min即可。
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(7) 30s后重复以上(4)～(5)步过程。
立即用TBE洗2×5min终止反应，再用TBE洗3×5min。
(9) 通过75％、95％和100％梯度乙醇各2×5min脱水，二甲苯5min透明，然后立即封片。
注：也可将冰冻切片铺在切成小片段的载玻片上，放入试管中进行以上试验。其优点是在PCR扩增可进行热启动。缺点是手续繁多且易于损坏标本。
四、 HIV-1前病毒 DNA的原位PCR检测及流式细胞仪分析
新近发展起来的原位PCR技术结合了PCR和原位杂交两个技术的优点，目前已被广泛地应用于临床疾病，特别是感染性疾病的诊断。其检测敏感度可达到培养细胞和临床标本上的特异DNA(或逆转录RNA)序列的单拷贝水平，又能定位靶序列阳性细胞。这样就解决了标准PCR过程需不可避免地破坏组织和细胞以提取核DNA而使扩增的靶序列在细胞或亚细胞结构中无法定位的难题。流式细胞技术能对细胞的重要参数进行定量测定，并对不同种类细胞可以进行快速分选，在肿瘤学、细胞生物学、临床医学领域中得到广泛的应用。
该部分介绍的是一种敏感的原位PCR程序。该法在PCR产物中直接掺入地高辛标记的dUTP，可对人类细胞的免疫缺陷病毒—I型(HIV－I)前病毒DNA进行检测并用流式细胞计数分析HIV-I阳性细胞。本方法的灵敏性已达到1／10000精度。并已成功地应用于不同期的HIV-I感染人群外周血单核细胞HIV-I前病毒DNA携带细胞的百分率的检测，最合适的检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切血清学依据的人群如HIV阳性母体所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者，目前成为HIV-I感染的主要监控手段和制定治疗计划的重要参考标准之一。
(一) 试剂和材料
1．细胞和培养液部分
(1) PBMC的获得取自于HIV－I阳性血清患者(制备HIV-I阳性血清患者的未固定的PBMC和淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞必须在有适当保护设施)和健康献血者(阴性对照)。
(2) 8E5LAV淋巴母细胞瘤细胞系 每个细胞上含有一个整合的HIV-I病毒基因组拷贝，以及每次实验中的阳性和阴性对照细胞。
阳性对照
用HLA－DQ(α)特异寡核苷酸引物分析PBMC或淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞。
用HIV-lgag寡核苷酸引物分析淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞。
阴性对照
用HIV-lgag特异寡核苷酸引物分析采自HIV-I阴性血清供血者的PBMC。
用非特异的寡核苷酸引物分析淋巴母细胞瘤细胞。以上特异或非特异的寡核苷酸引物序列参考 “表(3-5)引物序列”。

表(3-5)引物序列
7131—7155 λ噬菌体 5’GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG3’7606—7630 λ噬菌体 5’GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC 3’1551—1578 HIV-lgag(SK38) 5’ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT 3’1638－1665 HIV-lgag(SK39) 5’TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC 3’HLS DQ(α)(GH26) 5’GGTGTAAACTTGTACCAG 3’HLS DQ(α)(GH27) 5’GGTAGCAGCGGTGAGTTG 3’
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(3) RPMI-1640培养液。
(4) Iscove改良的Dulbcco培养液(IM－DM)。
(5) 胎牛血清(FCS)。
Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d＝1077g／mllPharmacia。
2. 固定和渗透性处理
(1) PBS。
(2) 多聚甲醛(PF)用PBS配制1％的PF，pH7.4
注：在抽风厨中加热混合液到50～60℃，然后室温冷却，存于4℃，于固定前现配，存放2周以上的固定液不能使用。
(3) 链霉蛋白酶(pronase)储存液浓度为 10mg／ml，溶于 PBS中，或 50mmol/L Tris－HCl，5mmol/L EDTA，pH7.6中。在37℃下保温 2h，然后分装存于－20℃。
(4) 37℃水浴。
(5) 台式离心机。
3. 原位PCR
(1) dNTP，存于－20℃。
(2) 地高辛-11-dUTP，存于－20℃。
(3) Taq聚合酶(5U／ml)，存于－20℃。
(4) 寡核苷酸引物序列见“表(3-5)引物序列”。存于－20℃。
(5) 10×PCR缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.3， 500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2。存于－20℃。
去离子水。
(7) 矿物油。
4. 放大产物的检测及阳性细胞的流体细胞计数分析
(1) 阻断剂(作用为避免非特异抗体结合)，100mmol/L Tris-HCl pH7.6和150mmol/L NaCl，保存于4℃。
(2) 荧光素抗地高辛抗体用1％阻断剂以1：100稀释，临用前配制。
(3) 有氩激光装置及适当软件程序的流式细胞计数仪(如LysisⅡ，Becton-Dickin-son)。
(4) 配有紫外线灯和适合荧光检测的滤光片的荧光显微镜。
(二)操作方法和步骤
1. 细胞制备
(1) 在37℃，5％CO2湿润条件下，用RP－MI-1640培养液(加 10％FCS)培养指数生长的淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞最佳密度为(1～2.5)×106/ml，室温下离心300g,5min，收集细胞小团，用 PBS洗 2次，以 2 × 106浓度重悬于PBS中，并立即处理。
(2) 采集HIV-I血清阳性患者或健康献血者血标本，放在含有7.5％EDTA-钾盐的Vacationer管中，在4h以内按以下程序处理：(最佳密度为1～2.5 ×106 /ml)
1) 用IMDM按1：l稀释静脉血标本，仔细地将5ml稀释血液加在盛于离心管内的4ml Ficoll His opaque密度梯度溶液上(不要让稀释的血液与密度梯度液混合)。
2) 在18～20℃下 400g，离心30～40min。
3) 用吸管吸去上层的血浆,留下分界面上未受扰动的淋巴细胞层。
4) 用另一新的吸管将淋巴细胞移到干净的离心管中。
5) 加至少3倍体积的PBS轻轻地重悬细胞，并用 PBS洗 2 ×5min，用 PBS以终浓度为1×106细胞/ml重悬细胞并立即处理。
2. 固定和渗透性处理
(1) 将 0.5～1×106的各种细胞标本分别放在微离心管内。
(2) 600g离心5min，弃上清。
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(3) 用250μl PBS重悬细胞，并重复(2)。
(4) 重复(3)。
(5) 用 300μl％多聚甲醛PF(溶于PBS pH7.4)固定细胞，室温下2h。(其他方法也可获得好的固定效果，如用 4％PF 30min，或 2％PF室温下2h)。
用 250µl PBS洗 2 ×5min，同(2)。
(7) 每管标本加200µl链霉蛋白酶溶液(10µg/ml)37℃水浴中5min。(蛋白酶处理对每一批酶和细胞类别都应确定正确的浓度和处理时间。在本实验中，蛋白酶浓度在10～20µg／ml，孵育5min，可获得最好效果并能很好地重复。如果省略渗透处理步骤，或渗透无效，阳性细胞的百分比会大大减少)。
在PCR机内95℃加热5min或煮沸2min使蛋白酶失活。
(9) 室温下用 250μl PBS洗标本 2×5min，600g离心5min，弃上清。
3. 原位PCR
注意所有材料和用具必须常规清洗并消毒，微移液器与微离心管作为原位PCR实验专用应与其它实验分开。
(1) 反应混合液的制备：第1管----49.5μl；，含以下成分：10mmol/L Tris-HCl，pH8.3；50mmol/L KCl；2.5mmol/L MgCl2(对PBMC和淋巴母细胞瘤 8E5LAV细胞系的最佳MgCl2。浓度为1.5～3.0mmo1/L，活性的顶峰通常在2.5mmol/L)；dATP，dCTP，dGTP每种各220µmol/L；dTTP215µmol/L；7µmol/L地高辛－dUTP(为了避免非特异性背景， dTTP与Dig-dUTP的比例在10：1到30：1比较好)；200µmol/L引物。
(2)从第1管取2.5μL溶液加入第2管，置冰上。
(3) 将制备好的细胞标本重悬于第1管溶液中。
(4) 将第 1管放入 PCR机中 82℃加热6min。
(5) 加 0.5µl Taq聚合酶到第 2管，仍放在冰上。
立即将PCR机的温度调至65～70℃，将第2管中的内容物加到第1管内，然后用预热到 65～70℃的矿物油 50µ l覆盖。
(7) 设置如下热循环程序：94℃5min→55℃90s→72℃90s→94℃60s×35次循环。
将标本置于冰上冷到4℃，用微移液器尖端从离心管底部吸取细胞放入Eppendorf管中(避免吸入矿物油)。用 250µl PBS洗2次，600g室温离心 5min。
4. 检 测
(1) 将细胞标本悬于含l％阻断液的溶液中37℃孵育10min。
(2) 室温下 600g离心5min。
(3) 再悬细胞于含荧光素—抗地高辛多克隆抗体(1/1000稀释于1％的阻断溶液中)，室温下孵育30 min。
(4) 用 250µ l PBS洗 2 ×5min，室温下600g离心5min，再悬于 350µl PBS中。
(5) 将每种细胞悬液标本的一小滴放在载玻片上，用盖玻片覆盖，在荧光显微镜下分析，荧光通常出现在大多数阳性细胞的核中。
注：在应用标准PCR方法中，一个值的注意的问题是由于标本污染引起假阳性的结果。原位PCR扩增的产物主要位于核膜以内，虽然偶尔也会显示弥散的细胞浆阳性，理论上扩增产物可从阳性细胞弥散进入阴性细胞，然而不可能像污染那样弥散到阴性细胞核内。因此，用细胞内荧光素的形态学检查来鉴别阳性细胞应该结合流式细胞计数分析结果
根据说明书标准化流式细胞计数仪的灵敏度，用事先制备好的鸡血红细胞或刻度珠校准仪器，使仪器的荧光信号足够的大，CV值尽量小。
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(7) 将以上制备好的细胞悬液上机检测。收集一定数量的细胞检测结果并存入计算机。
推荐的上机顺序是：阴性对照，检测标本，阳性对照。不同的样品分别有四个检测通道：FSC—前向角散射，表示细胞大小；SSC-90°散射，表示细胞的颗粒性；FL1—测绿色荧光；FL2—测红色荧光。
处理结果并打印。
五、 细胞内mRNA的原位PCR扩增
近年来，PCR与逆转录酶结合的逆转录PCR(reverse tran-scription PCR，RT-PCR)技术得到了大量的改进，在基础研究和临床诊断方面被越来越广泛的应用，原位RT-PCR技术也由此应运而生。原位RT-PCR可将mRNA原位反转录为cDNA，然后进行原位PCR，因此可用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，比如定量细胞表达特殊mRNA的丰度或检测扩增产物的细胞起源。其优点是逆转录后，即在显微镜观察的载玻片上进行扩增，鉴定信号细胞起源，不需从标本中提取mRNA。这样，就不会有在核酸的分离步骤中潜在的信号丢失。该技术也可用于检测细胞群中基因表达的趋势。
该技术的一个要点是要保持酶和试剂可以自由地进入细胞的渗透性和PCR产物保留在细胞内不扩散性之间的平衡。这常常是比较困难的。实验表明，反复摸索最佳的固定和消化条件并形成严格的程序是非常重要的，对每个所使用的引物必须进行仔细地设计。
本文介绍将活化的人外周血淋巴细胞离心制备在载玻片上，然后进行原位PCR以检测粒酶A(granzyme A)和穿孔素(perforin) mRNA的方法。粒酶A和穿孔素是细胞毒 T－细胞、NK细胞和活化的淋巴细胞因子杀伤细胞的功能标记物，在试管中激活后可在成人周围淋巴细胞检测出。本技术将生物素化的核苷酸直接掺入到PCR产物中，然后用抗生物素抗体的免疫细胞化学方法来检测标记物，本法不适合用于组织切片，因为受损的 DNA可以启动并延伸这个反应，标记的核苷酸可以被结合到非特异的产物中，产生非特异性结果。
(一) 试剂和材料
1. 载玻片制备部分
(1) 载玻片和盖玻片。
(2) Decon90。
(3) 丙酮。
(4) 3－氨丙三乙基硅烷(3-Aminopropy-triethoxysilane，Sigma)。
(5) 溶于四氯化碳的l％二甲基二氯硅烷(Dimethyl dichlorosilane)。
DEPC(Diethyl pyrocabonate)处理的双蒸水(DEPC-ddH2O)。
注：实验中应尽量避免 RNA酶污染。先配制0.1％DEPC水溶液, 37℃下放置过夜，并在使用前高压消毒 30min。所有溶液均需用此DEPC溶液配制，但Tris缓冲液不能用DEPC直接处理。玻璃器皿及金属用品应用铝箔包裹，在 200℃烤炉中烘烤4h以除去RNA酶。操作中必须戴手套，如载玻片必须放在实验台上，应在台上铺一层铝箔，并用镊子镊取载玻片。
2. 细胞制备部分
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(1) PBS。
(2) PHA(植物血凝素) 1mg/ml。
(3) 淋巴细胞分离液。
(4) 人外周血(抗凝)。
(5) PMA (Phorbol-12-myristate-13acetate)500ng/ml。
RPMI-1640 加入 10％FCS，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素。
(7) 37℃组织培养箱。
可做细胞离心涂片的冷冻离心机。
3. 固定部分
从此步开始，保证实验在无RNA酶环境中进行。
(1) 临用前用DEPC-PBS配制4％的多聚甲醛溶液。在通风橱内加热混合液至60℃并持续搅拌至少1h，让多聚甲醛完全溶于DEPC-PBS中，冷却至室温使用。
(2) DEPC－3×PBS，DEPC－l×PBS。
(3) DEPC－双蒸水。
(4) 50％、80％、100％梯度乙醇，均用DEPC-双蒸水配制。
4. 蛋白酶K消化
以下所有均为储存液。
(1) 蛋白酶K 10mg/ml溶于0.1mol/L Tris-HCl，pH8.0。
(2) 1mol/LTris-HCl，pH8.0。
(3) 500mmo1/L EDTA，pH8.0。
5. 杂交和逆转录
(1) 杂交溶液：50％甲酰胺；10％硫酸葡聚糖；300mmo1/L NaCl；20mmol/ L Tris- HCl，pH7.6；5mmol/L EDTA；1×Denhardt's；10mmo1/L DTT。
(2) 1μg/ml的反义引物序列。
(3) MMLV逆转录酶(Life Tech公司)。
(4) 5×逆转录缓冲液。
(5) 100mmo1/L dNTPs原液。
100mmo1/L DTT。
(7) RNA酶抑制剂。
牛血清白蛋白(BSA) 10mg/ml，DEPC-H2O配制。
(9) DEPC-ddH20。
(10) DEPC-2×SSC。
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(11) 湿盒。
(12) 42℃杂交炉。
(13) 37℃杂交炉。
6. 原位PCR
(1) Taq聚合酶。
(2) 10×Taq聚合酶缓冲液。
(3) 100mmo1/L dNTPs原液。
(4) 22.5mmo1/L生物素-11-dUTP。
(5) 25mmol/L MgCl2。
矿物油。
(7) 二甲苯。
PCR机。
(9) 粒酶A引物
5'-CCAGAATCTCCATTGCACGA 5'-CTGTAACTTGAACAAAAGGT
(10) 穿孔素引物
5'-ACATGGAAACTGTAGAAGCG 5'-GGATTCCAGCTCCATGGCAG
7. 扩增产物的检测部分
(1) 人AB型血清。
(2) 10％BSA(溶于PBS)。
(3) 辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗小鼠IgG抗体。
(4) 小鼠抗生物素单克隆抗体。
(5) 底物DAB 0.6mg/ml，溶于PBS，每毫升中加3μl 3％H202，使用前现配。
70％、90％、100％梯度乙醇。
(7) 苏木精。
DPX封片液。
(9) PAP蜡笔。
(10)保湿染缸。
(二)操作方法和步骤
1. 玻璃载玻片和盖玻片的制备
(1) 将玻片浸入用双蒸水配制的10％ Decon 90中清洗过夜，然后依次用：热流水冲洗→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→放在片架上空气干燥，铝箔包裹→200℃烤4h以破坏 RNA酶活性。从此开始，所有玻璃器皿均不能有RNA酶。然后在含有2％Tespa的丙酮溶液中孵育2min包被载玻片，新鲜丙酮洗2次，DEPC-双蒸水洗2次，铝箔轻轻包裹，37℃烤炉过夜,存于室温。
(2) 盖玻片应用硅处理以利于实验过程中揭去。将盖玻片浸入溶于四氯化碳的1％二甲基二氯硅烷1min，用双蒸水洗净，铝箔包裹，200℃烘烤4h，室温储存备用。
2. 细胞的制备
(1) 用PBS按1：2比例稀释人外周血，通过淋巴细胞分离介质600g 20℃离心25min分离淋巴细胞。
(2) 从梯度界面收集淋巴细胞，用PBS至少1:2稀释,400g 20℃离心7min。收集沉淀，用PBS洗2次，300g 20℃离心5min。
(3) 以1×106细胞/ml的浓度再悬细胞于RPMI培养液中，并用溶于RPMI/FCS的 100ng/ml PMA和50μg/ml的PHA刺激细胞。
(4) 4d后，300g，20℃离心5min收集细胞。
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发表于 2011-8-24 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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(5) 用DEPC-PBS缓冲液洗细胞，然后将细胞悬液滴在Tespa处理过的显微镜载玻片上，用细胞离心机80g 20℃离心5min使细胞沉淀到载玻片上。
3. 固定
(1) 将有细胞沉淀的载玻片置于烘烤过的片架上，室温下空气干燥5min后按以下过程固定细胞：4％多聚甲醛20min→3× DEPC-PBS 5min→1×DEP&PBS 5min→1×DEPC-PBS 1min→DEPC-双蒸水lmin→ 50％乙醇+50％DEPC-双蒸水1min→80％乙醇+20％DEP-双蒸水lmin→100％乙醇 lmin。
(2) 空气干燥后用铝箔包裹存于－80℃。
4. 蛋白酶K消化
(1) 将有细胞的载玻片放入装有溶于 0.1mol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA， pH8.0，浓度为10μg/m1的蛋白酶K的2L大烧杯中37℃消化30min。
注：细胞的固定和消化对该技术的成功至为关键，其条件可因细胞类型、PCR产物大小及mRNA的稳定性不同而有差异，应根据每个实验要求进行优化。
(2) 重复3，再次固定细胞。
5. 杂交和逆转录
在以下所述过程中，载玻片置于用铝箔覆盖的工作台上。
(1) 在有细胞的载玻片上，滴加10μl含有2.5ng/μl对人粒酶A或穿孔素基因反义寡核苷酸的杂交溶液，用烘烤过的镊子小心地在细胞上盖上盖玻片，湿盒中42℃孵育2h。
注：杂交时间需凭经验确定。虽然延长杂交时间有助于寡核苷酸与mRNA的结合，但不稳定的mRNA可降解，产生不完整的cDNA。
(2) 孵育结束后用2×SSC彻底地洗片5min以洗掉盖玻片和杂交液。
(3) 甩去载玻片上的液体，并用软纸吸去多余水分，空气干燥。
(4) 每个标本加7μl逆转录混合液，用新盖玻片盖好，湿盒中37℃孵育1h。
(5) 逆转录混合液含有：3U/μl逆转录酶，溶于75mmol/L KCl，10mmol/L Tris pH8.0，12mmol/L MgCl2，2μg/μl BSA，10mmol/L DTT，各种1mmol/L dNTP及 1U/μl RNA酶抑制剂。
用大量2×SSC缓冲液洗5min，再用双蒸水清洗一遍后晾干。
6. 原位PCR
在原位PCR中，对照是非常重要的。
(1) 用钻石玻璃刀将盖玻片切成1cm2大小，减少 PCR过程中试剂用量。
(2) 原位PCR反应液 0.5U/μl Taq聚合酶；1mmol/L dATP、dCTP、dGTP和 0.9mmol/L dTTP；0.1mmol/L生物素-11- dUTP；75mmol/L KCl；10mmol/L Tris，pH8.0；10mmol/L MgCl2；7μmoL/μl 5’-3’端与人粒酶A或穿孔素基因互补的寡核苷酸引物。每个标本上加5μl以上杂交反应液。
注：(原位PCR比试管PCR需要更高浓度的试剂，尤其在MgCl2，Taq聚合酶和核酸方面。因此，不能照搬试管PCR的优化条件)。
(3) 用切小的盖玻片盖住混合液，并滴一滴矿物油封住盖玻片，以防蒸发。将载玻片放入PCR机内。
注：(传统的PCR热循环机的热格对原位PCR不适用，应选用具有热平板的特殊设计的机器。如果PCR过程中标本干燥可产生假阳性信号，因此应用矿物油完全密封盖玻片)。
(4) 扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃ 1min→60℃lmin→72℃ 1min，循环30次；最后在72℃保持10min。
(5) 完成PCR扩增后，将载玻片浸入二甲苯中2min洗去矿物油，将载玻片放在抽风厨中使二甲苯挥发。
用70％乙醇喷洒载玻片，并用软纸擦去载玻片上遗留的矿物油。因为水化油滴可干扰抗体，影响PCR产物的检测，故在免疫组化染色之前，必须完全清除矿物油。
(7) 将载玻片置于片架上，在2×SSC中摇动片架以使盖玻片脱落。 然后用大量2×SSC和PBS充分洗涤，最后空气干燥。
7. 检测扩增产物
(1) 用蜡笔围绕细胞画一圆圈，使滴加的试剂局限于标本上。
(2) 在PBS中漂洗载玻片，每个标本上加 50μl小鼠抗生物素单克隆抗体稀释液(1:25稀释在含0.5％BSA的PBS中)，湿盒中 37℃孵育30min。
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(3) 用PBS洗片3×5min。
(4) 每个标本上加50μl HRP-兔抗小鼠 Ig抗体稀释液(1:50稀释在含10％人AB型血清和0.5％BSA的PBS中)，湿盒中37℃孵育30min检测第一抗体。
(5) 用PBS洗片3×5min后，用新鲜配制的底物溶液(DAB和H2O2)显色。
用Harris苏木精复染。
(7) 经过70％、90％、100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明并用DPX封片。

表(3-6) 原位cDNA PCR阴性对照
  A  B  C  D  E  F  G  H
杂 交  +  +  +  +  -  +  +  +
逆转录  +  +  +  +  +  +b  +  +
PCR  +  +  -  +a  +  +  +c  +d
抗生物素抗体  -  -  +  +  +  +  +  +
HRP－偶联二抗  -  +  +  +  +  +  +  +
底 物  +  +  +  +  +  +  +  +
期望结果  -  -  -  -  -  -  -  -
反应(A)中产生的阴性结果将证实标本中不存在内源性过氧化物酶。反应(中证实不存在非特异性 HRP-偶联的第二抗体。反应(C)和(D)将显示在标本中无内源性生物素或无单独的RT信号。反应和是特别重要的对照，阴性结果证明信号产生于cDNA的扩增而不是产自于由裂缺DNA引导或基因组DNA扩增。反应证明对引物的需要。表明信号由Taq聚合酶产生。
a省去生物素化核苷酸；b.省去逆转录酶；c.省去引物；d．省去Taq聚合酶e.用HRP辣根过氧化物酶

8. 注意事项
为了取得满意的实验结果，请注意以下两点：
(1) 在原位PCR系统，设立对照是非常重要的。阳性对照采用持家基因(house-keeping gene)引物在实验细胞上证实mRNA的存在。用已知有目的基因表达的阳性细胞应作为阳性对照，以证实实验条件的合理性。阴性对照在此系统特别重要，表(3-6)为推荐的阴性对照。
(2) 用原位PCR反应的上清液作Southern印迹分析可证实扩增产物的特异性。
六、 组织切片上核酸序列的PCR扩增
——定位原位扩增
原位杂交(ISH)方法用于定位检测细胞和组织切片内的核酸序列，其不足之处在于很多感兴趣的目标是单拷贝基因，对这些基因的检测超出了ISH灵敏范围。多聚酶链式反应(PCR)是80年代以来广泛应用的体外基因扩增技术，具有高度特异性和敏感性，能对正常和许多疾病情况下的核酸靶序列进行分子水平的分析，常被用于扩增罕见或单拷贝基因序列，是理论研究和临床实验的一个重要分子工具。PCR分析的焦点集中于组织核酸的分离、纯化和扩增过程，不对靶序列进行细胞组织类型定位。
原位PCR将PCR和ISH相结合，形成一个具有高灵敏性和高特异性的定位研究新技术。过去许多实验室的工作限于利用原位PCR技术来检测组织标本上感染性病原体——即外来的核酸序列，很少用于检测细胞内新表达的基因及基因变异，其原因是后一种情况下检测的靶序列十分稀少。以前很难于用ISH检测到的单拷贝DNA靶序列,现在可以用这种叫定位原位扩增(licalized in situ amplification, LISA)的方法加以扩增和检测。
实践证明，本章所述的原位PCR方法特别适用于常规醛类固定、石蜡包埋组织上核酸序列的检测，对外来核苷酸系列、基因组变异检测和基因治疗效果监控等方面都非常有效。
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