小中大第三节 定量PCR 技术基本原理
在实验生物学及医学中,由单纯PCR 所提供的阳性或阴性结果还远远不够阐述问题的本质时,基因及其表达的定量起着至关重要的作用。根据PCR反应的指数增长特性,通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系,以达到对后者进行定量之目的。因为PCR反应每个循环的产物均成为下个循环的底物,并按指数级扩增,所以可用方程式Y = X (1 + E )n来推算扩增产物,Y 代表PCR产物,X 指起始模板核苷酸的量,n指反应循环数,E在有限的循环周期中保持相对恒定,通常是20～ 30 个循环,随后扩增效应减慢直至为零,扩增过程到达平台期,此时,PCR 产物的积累不再依赖于投入的模板核苷酸量。因此,在使用上述方程式前,必须用实验检测PCR 扩增的指数增长特性。在PCR 扩增的指数增长过程终止前的循环数的多少取决于扩增效率E 和起始样本的特异核酸序列丰度。对于一个给定的扩增片段, 起始样本的含量越大,则指数扩增过程越短。扩增过程中的内在特性或参数很可能会引起动力学的变化, E 取决于诸多因素, 包括引物和扩增序列的特性、组份的浓度以及PCR反应温度等。其中特别是DNA聚合酶量/模板量的商值,它可能会随着热循环仪上标本位置或不同临床标本中某个DNA聚合酶抑制物的出现而变化。即使在同一条件、使用同一试剂的条件下,管与管之间的扩增效率也可能发生变异。影响E 的因素中任何微小的差异将导致特异PCR 产物水平的极大变化。显而易见,与那些处于良好状态下的标本相比,某些相似的样本所含的特异靶序列已部分降解,含量减少。由于RNA 易于降解和在逆转录过程中效率的不稳定性, 样品问题更加突出。围绕这些问题, 一些方法被改进以期尽可能地消除这些变异达到精确定量。与非定量PCR 分析方法不同,定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况,即测出污染的程度,即使负对照产生了正的信号,只要这些信号比实验样品中的低得多,依据这样的结果,至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。
第四节 定量PCR技术的种类
在定量PCR技术发展之初,人们进行的一些探索主要集中在相对定量方面,通过同位素、生物素标记引物或dNTP的方法进行扩增,扩增产物通过杂交,免疫捕获等方法,根据扩增后产物的发光强度推测目的基因的初始模板数。这些方法繁琐、费时,可重复性差,并且具有放射性危害,而且往往偏重于通过评估样品间核酸含量差异的粗略定量,没有充分考虑扩增过程中的各种影响因素及扩增效率的差异造成结果的不准确性,多为相对定量的方法。从定量PCR 反应动力学分析中可以看出, 最符合PCR数学模型,最易于操控,最有前途的定量PCR 技术就是竞争性PCR ,故竞争性PCR成为定量PCR的基础。目前定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测,将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的数值联系起来,为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。定量PCR 在这些方面的应用,特别是阈值的选择,仍需进行大量的研究工作。
定量PCR技术在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物,参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。内参照和外参照均是在定量PCR过程中一种已知含量的标准品。内参照与待检样本一起加于同一扩增系统,与待检样本共用同一对引物或采用另一对不同引物。内参照若与待检样本共用同一对引物,两模板的扩增存在竞争性,则内参照又称为竞争性参照物, 这种条件下进行的定量PCR又称竞争性定量PCR。若内参照与待检样本不共用同一对引物,这种定量PCR 因其不存在竞争性故属非竞争性定量PCR。外参照与内参照相对而言, 独立于待检样本定量PCR 扩增系统, 常采用系列稀释的已知含量标准品。在非竞争性定量PCR中,通过外参照单独扩增建立标准品初始含量与最终产物之间的标准曲线用于未知样本的类推定量。采用外参照进行的定量PCR亦属非竞争性定量PCR。参照物在定量PCR中具有以下作用:①作为扩增系统的阳性对照。②作为未知样本定量的参比标准。③通过竞争性作用校正扩增系统之间的扩增效率, 使其具有可比性。理想的竞争性内参照应具备与待检样本长度相等或相近,扩增效率相同,通过一定方法扩增产物较易与靶基因扩增产物分开的特点。在竞争性PCR中通过梯度稀释系列标准品与已知含量的内参照混合扩增而作出初始状态下标准品含量与竞争模板含量比例和靶基因终末产物的标准曲线，用于待检样本的定量。
在PCR 定量体系中,人们常提及相对定量和绝对定量的问题。相对定量的目的是评估样品间核酸含量的差异,绝对定量的目标是确定某个样品准确的分子数。通常比较样品间核酸分子的相对含量而不是绝对分子数对于很多应用场合已经足够。在DNA水平, 因为很容易获得精确对照,即使只要求相对定量值,人们也倾向于报道绝对数值。大多数mRNA含量在整个细胞周期中变化很大,且很难获得精确的RNA对照,所以mRNA的相对定量被广泛应用。在一些方法中,相对和绝对定量的区别并不很显著。任何定量工作的准确性都在本质上与所用标准的准确性相关联。目前,一些定量PCR方法虽各有优缺点,但已得到了一定程度的应用和发展。选取何种方法,须由靶序列特性、靶序列分子数的估计范围、定量要求的精确程度和相对与绝对等因素来决定。各种定量PCR 方法联合使用的例子也经常出现。所有Q-PCR 方法均要求进行检测和核实,以保证结果的可重复性和统计学的可靠性。除了有限稀释度方法,其它方法都须对产物本身进行定量。
