PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 157  8/16 |‹‹‹6789101112131415›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
71

发表于 2011-8-24 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2. Amplisensor 技术（图4-2）

图(4-1).TaqMan探针的原理
R：报告基因；Q：淬灭基因


图(4-2).Amplisensor引物荧光定量PCR的原理
R：报告基团； Q：淬灭基团

Amplisensor 是一种复合探针技术,一个探针上连接一种荧光物,另一个探针连接一淬灭物,两探针的长度不同,其中淬灭物标记探针5′端多出7 个碱基( GCGTC2CC) ,PCR 扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR 引物连接,PCR 引物的5′端应有一段与长探针互补的序列,以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针-引物复合物作为半套式引物掺入到模板,从而释放出淬灭探
针部分,破坏FRET ,产生荧光。荧光强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点: (1) 每次PCR 反应前,需进行Amplisensor 标记,增加了操作步骤和检测成本。(2) 采用半套式PCR 扩增提高了灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成的非特异扩增信号,易造成假阳性。(3) 反应中需加入半套式引物,污染的机会增加。Matera G等用AmpliSensor 技术对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV) 的基因型进行检测,发现此方法具有很高的特异性,能准确检测待测标本中DNA 的基因型和含量。

图(4-3).分子信标杂交定量的原理
R：报告基团：Q：淬灭基团

3. 分子灯塔技术 （图4-3）
亦称分子灯塔法,分子灯塔(Molecular beacon，M是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针,其链由两部分组成,一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列,是检测靶基因的部分,位于探针的中间位置,探针形成后构成探针的环部,另一部分是分别在5′和3′端的荧光标记物质和荧光淬灭剂。5′和3′端有几个互补的碱基存在,因而可形成两端反转配对,构成探针的茎部。在游离状态下,分子灯塔形成茎-环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭,此时茎环结构的分子灯塔发出的荧光检测不到。而在PCR变性过程中,靶基因双链打开形成完全互补的单链，经过复性即可发生杂交。杂交的结果使探针5′和3′端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光。而在PCR 的延伸阶段,分子灯塔又从模板上解离,重新形成茎环结构,荧光消失。因此,随着每次扩增产物的增加,其荧光强度也增加,因而它可反映每次扩增末期扩增产物积累的量。Helps C 等报道此种技术对动物衣原体感染的诊断有一定的特异性,它可以特异性的鉴别衣原体的外膜蛋白基因,且具有高度的可重复性。
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
72

发表于 2011-8-24 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
图(4-4).蝎状引物PCR荧光定量原理
R：报告基团； Q：淬灭基团； S：间隔臂
最近 Whitcombe等将上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion primer）的荧光定量PCR技术（图4-4）。该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但是当有特异扩增产物时，MB即可以同扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是，仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配以及合成复杂的问题。
4. Lightcycler 技术
Lightcycler 是Roche 公司最近开发的一种PCR 定量技术。该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发生探针和淬灭探针，前者5′端连接荧光分子，后者3′端连接淬灭分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR 定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两种探针结合于模板上会影响扩增效率。此外,由于需要合成较长的探针，成本较高。Kearns AM 等报道，Lightcycler 技术在对病毒DNA 的快速分型和定量方面有特殊的优势。
5. 复合探针法(Complex Probes) 　
该法的基本原理则综合了Roche和MB两种技术的优点,并克服了他们的不足。首先合成两个探针,一个是荧光探针(25bp)，在5′端接一个荧光分子,另一个为淬灭探针(15bp) ,在3′端连接一个淬灭分子,淬灭探针能与荧光探针的5′ 端杂交。当两个探针结合时,荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收,溶液中没有荧光产生,但两个探针分离时,荧光探针发出的荧光不再被淬灭探针吸收,溶液中即可检测到荧光。当PCR 扩增时溶液中无模板时,两种探针特异性结合,无荧光产生,相反,在模板存在的条件下,两探针分别与模板结合,从而使两探针分离,产生荧光。荧光强度与溶液中模板数量成正比,因此,可进行PCR 定量。其优点: (1) 使用非荧光淬灭剂,本底低。(2)对扩增效率影响小。(3)探针设计、合成、标记、纯化方便。
6. SYBR 荧光染料　
在PCR 反应体系中, FQ-PCR 的荧光标记可分为荧光探针标记和荧光染料标记两种。SYBR 荧光染料能特异性地掺入DNA 双链,发出荧光信号,而不掺入DNA双链中的SYBR 染料分子不会发出任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针,其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA 产生时,其荧光也同样增强,此法与常规PCR 的特异性差别不大。
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
73

发表于 2011-8-24 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
(二) FQ-PCR 技术在医学上的应用
1. 在常见病原体检测中的应用　
HBV 的检测　
以前,对乙肝病毒的检测主要依靠乙肝表面标志物这种间接指标。多年来也确立了一套较为稳定而准确的HBV 检测方案。但在临床实际运用中,仅仅根据HBsAg阳性或阴性很难判断该患者体内病毒是否处于复制期,病毒复制的量又如何,以及患者是否具有传染性。随着PCR的出现,人们得以运用此种快速的方法来检测HBV ,但也只能定性检测。直到1996 年实时FQ-PCR 的出现,才真正解决了这一难题。它可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数。研究证实,HBV e抗原阳性的乙肝患者有97 %HBV-DNA阳性,HBV e抗体阳性的患者有37%HBV-DNA 阳性。结果表明e抗原阳性患者体内大多有乙肝病毒存在,而e抗体阳性患者有37 %左右体内存在乙肝病毒复制情况,即此类患者有传染性,需注意与家人的隔离。HBV-DNA (HCV-RNA)结果为101～105拷贝/ml时,表明病毒复制水平较低,传染性较弱,而当HBV-DNA大于105拷贝/ml 时,表明病毒复制水平高,传染性强。另外HBV-DNA 定量检测可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。研究结果显示,对于低拷贝量(小于105 拷贝/ml)的乙肝患者,干扰素治疗效果尚可,而对于高拷贝量感染的患者,干扰素疗效较差。因此通过检测HBV-DNA 水平来决定是否选用干扰素,可大大提高治疗的成功率。1998 年底我国药监局批准拉米夫定用于治疗慢性乙型肝炎患者。目前国内外学者对拉米夫定使用有了一个较为明确的范围,其治疗效果可用HBV-DNA含量进行监控,随着拉米夫定的广泛应用,HBV对拉米夫定耐药株的出现引起了大家的关注,耐药株出现后,HBV-DNA水平明显升高,可升高3个指数级以上,随后出现转氨酶及胆红素升高等肝功能损伤标志。耐药株的出现发生在使用拉米夫定治疗28 周后,尤其是治疗一年后发生率可达25%。通过HBV-DNA 定量检测观察到拉米夫定耐药后,可辅助医生及时调整治疗方案,不至于贻误病情,浪费时间和财力。
HCV 的检测　
HCV 是一种RNA 病毒,HCV-DNA 的出现先于免疫血清学标志3～4 周,能更及时地检出病人的感染状况和病原体的复制水平,有利于病人早诊断、早治疗。目前COBAS Amplicor 法被公认为一种具有良好准确性和重复性的HCV-RNA的PCR 定量方法。但由于其设备和配套试剂极其昂贵,很难在临床实验室推广应用。FQ-PCR 是一种实时检测策略,即扩增和产物检测一步完成。检测过程无需打开扩增管,造成产物污染的可能性小,易为基础试验室接受,故而在国内应用较多。现已有一些国内厂商生产相应的试剂盒,可使用PE5700/ 7700 或Lightcycler 检测系统。Shigenobu 等报道RT FQ-PCR 检测血清中HCV-RNA 的含量比Amplicor Monito的结果高10～100 倍。而王露楠使用PE5700 法检测结果表明:RT FQ-PCR 检出的含量比COBAS Amplicor 约低5倍,这可能是由于国内试剂在提取、逆转录扩增等环节与国外产品存在一定差异。根据王露楠的方法比较得出:COBAS Amplicor与RT FQ-PCR 具有良好的相关性,并且其检测范围比COBAS Amplicor 大一个对数级,说明用FQ-PCR 来检测HCV-RNA 具有广阔前景。
对于其他常见病原体的检测　
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
74

发表于 2011-8-24 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
FQ-PCR 技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测,如人巨细胞病毒( HCMV)、EB病毒( EBV)、单纯泡疹病毒(HSV)、结核杆菌( T、解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NCG)、人乳头瘤状病毒(HPV)等。目前临床上正开展越来越多的基于FQ-PCR 的检测项目。
2. FQ-PCR在医学分子遗传学方面的应用
由于荧光定量PCR高灵敏、高特异性和精确定量的特点，在基础科研、临床检测和遗传学研究方面得到广泛应用。从一个复杂的模板合成大量特异DNA片段的这种能力在序列分析中有重要的应用价值。扩增DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞内的生长准备,即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得,由此,FQ-PCR可进行特异突变基因的检测。与FQ-PCR有关的一系列间接测序方法的建立,使其在研究领域的应用不断扩大。如对已知DNA 序列进行位置突变基因及序列多态性的定位,制备特异序列的探针和引物,扩增DNA限制性位点检测遗传变异,用于遗传标记研究的基因位点扩增等。而从mRNA 反转录扩增cDNA是基因表达测定的重要方法,此方法使在特异细胞株中检出mRNA成为可能, FQ-PCR 扩增单一模板的已知序列可用于重组基因及基因图分析。FQ-PCR 技术已广泛应用于基因变异、表达、重组和进化等分子遗传学研究。
3. 染色体病的诊断
过去对染色体病的诊断 ,多在细胞水平上进行染色体核型分析 ,该法具有费时长 ,对妊娠晚期的孕妇不利的缺点。1999年Lo等利用荧光定量PCR技术 ,分别对从香港和波士顿两个中心收集的怀有 21-三体胎儿母亲的血液中胎儿细胞游离 DNA进行定量检测。用胎儿Y染色体上的一段序列作为分子标记 ,运用实时定量PCR进行扩增，β球蛋白基因作为血浆DNA扩增的阳性对照。结果发现 ,在波士顿收集的标本中 21-三体胎儿母血中胎儿游离 DNA的水平是正常对照的 1.97倍；在香港收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离DNA的水平是正常对照的2.46倍。说明染色体异常的胎儿其母体血液中细胞游离 DNA的水平较正常胎儿的母亲血液中的细胞游离DNA水平增高。但是，这种方法仅限于男性胎儿，对于女性患儿无特异性，尽管如此，它为无创性染色体异常的产前诊断提供了一种新的思路。
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
75

发表于 2011-8-24 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4. 单基因病的诊断
在单基因病的诊断方面 ,对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光探针 ,然后对其进行扩增。若有基因缺失 ,将无荧光的产生。直接观察荧光的有无,免去了常规 PCR后的电泳检查 ,且敏感性大大超过常规的 PCR,现已能够对单细胞的核酸进行检测。1999年Laurendeau等对一个家族性皮肤黑色素瘤进行基因诊断。利用球蛋白基因为参照基因 ,对p15基因 (皮肤黑色素瘤基因 ,该基因定位于染色体 9 p21,皮肤黑色素瘤的发生与 p15、p1 6、p19等肿瘤抑制基因的缺失有关 )进行扩增。正常的 p15基因起始拷贝数 /球蛋白基因的起始拷贝数值为 1,结果发现在该家系的 11位被检者中 ,有 5例比值为0.9 19～ 1.019 ( SD,0.006～ 0.075) ,有 6例比值为0.472～ 0.556( SD,0.013～ 0.078)。在6例中有三例是该病的患者,另外的三例可能是高危发病者。 2000年Costes等对一对可能怀有囊性纤维化胎儿的母亲进行产前诊断 ,发现胎儿的致囊性纤维化基因的外显子 19可能有基因的缺失 ,他们应用 ABI7700PCR扩增仪 ,抽取胎儿脐带血和母亲的白细胞的 DNA进行19外显子扩增。结果发现 ,父母的19外显子的扩增效率低于对照的2倍 ,而胎儿的 19外显子基本没有扩增出来。表明胎儿极有可能是一个19外显子缺失的囊性纤维化的患者。因为该对夫妇已经属于妊娠晚期 ,要求继续妊娠 ,结果分娩了一个囊性纤维化的患儿。该报道将单基因病的实时定量 PCR的诊断范围进一步扩展。之后又有在进行性神经性肌萎缩、地中海贫血等其他遗传病诊断方面的多篇报道。
5. 基因表达的研究
mRNA体内表达水平的定量PCR应用之前 ,mRNA的定量是用传统的Northern印迹的方法 ,其定量的下限是 106 ～ 107个分子。这种方法要求的mRNA的量较大,其在基因表达研究应用上受到很大的限制。实时荧光定量PCR的发明,解决了这个难题。其灵敏度可检测到400个分子的 m RNA。它以其精确、快速、污染小,已广泛应用于分子遗传学领域。在1996年PE公司研制出ABI7700系列荧光定量PCR仪后 Gibson等随后即发表了用荧光定量PCR来定量细胞内的mRNA的文献。该文作者利用 PGEM-3Z质粒 DNA作为内对照 ,精确的定量了T84细胞经腺病毒介导,转入CFTR基因后其细胞内 CFTRmRNA的水平。有的学者通过检测肿瘤相关癌基因表达的水平来判断肿瘤的微转移或预后。
6. 基因突变及其多态性
在突变检测上 ,常规的PCR多用SSCP、RFLP、DGGE等方法 ,其操作费时,在处理大批量的标本时其工作量极大。与之相比荧光定量PCR运用特异性荧光探针和杂合曲线分析 ,用来检测突变则省事、省时无污染 ,在大批量的标本检测时其优势更加明显。Roch公司新近开发了一种实时荧光定量 PCR技术—— lightcycler PCR。分别设计两个探针 ,一个带有 3′端单标记荧光供体 ( fluorophoredonor)另一个 5′端单标记荧光受体 ( fluorophore acceptor)。退火时两条探针均与同一条模板相结合 ,它们之间相隔 1～ 3个碱基 ,荧光受体与荧光供体之间形成荧光共振能量传递。发光二极管激发 3′端单标记荧光受体 ,经荧光共振能量传递给5′端单标记荧光受体探针产生实时荧光而被检测。例如 ,设计一对跨突变位点的荧光探针 ,由于跨越突变位点的荧光探针与模板完全配对时的解链温度(Tm)比模板出现单个碱基错配时的Tm值要高 ,所以 ,在扩增结束后对产物进行缓慢加热,同时检测荧光信号。随着温度的增高 ,3′端单标记荧光供体探针逐渐与模板解离 ,使荧光共振能量传递系统 ( fluorescence resonance energy transfer,FRET)的结构破坏 ,荧光信号逐渐减弱 ,当到达Tm值时探针与模板完全解离,其荧光信号消失。根据荧光的变化 ,绘制熔解曲线。根据曲线的形状来判断有无基因突变。Walburger等运用 Tap-man实时PCR和 Lightcycler PCR对 43例遗传性血色病的 HFE C282Y基因同时进行突变检测其符合率达到百分之百。Parks等运用
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
76

发表于 2011-8-24 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
LightcyclerPCR对 155例凝血因子v基因突变,157例前凝血酶原基因突变,及 156例遗传性血色病的HFEC282Y基因突变 ,运用CR-RFLP和 Light-cycler PCR进行突变检测 ,来验证荧光定量 PCR检测突变的可靠性。他们针对这三种遗传病的基因突变 ,分别设计三对跨越突变位点的荧光探针 ,对跨越突变位点的一段基因进行扩增。扩增结束时,对产物进行缓慢加热以获得熔解曲线 ,根据熔解曲线判断是否有基因突变。结果诊断符合率达到百分之百。说明了运用荧光定量 PCR检测基因突变具有准确、快速的优点 ,同时能有效的减少污染。说明在单碱基突变的检测及单核苷酸多态性的检测方面有很好的应用前景。
7. FQ-PCR技术在其他方面的应用
医学诊断　由于特异核苷酸杂交探针的应用,感染性疾病致病基因的检测及与遗传变异相关疾病的确认发生了巨大变革。FQ-PCR 首先被应用于诊断单基因遗传病镰状细胞贫血,随后又用于诊断X连锁遗传病,如Duchenne′s 肌营养不良。当多态性DNA 序列与人类遗传性疾病位点连锁时,它就可作为遗传缺陷或携带者的标记,结合家族史综合分析作出诊断。用FQ-PCR 原理可诊断的遗传病有:苯丙酮尿症、脆性X综合症等。根据FQ-PCR 原理,一旦了解与疾病相关的特异DNA 序列,就可设计出探针和引物进行DNA诊断。因而FQ-PCR 可用于各种遗传病包括染色体病、免疫遗传病等的诊断。FQ-PCR分析HLA多态性的基因分型在器官移植配型和相关疾病的诊断中亦起着重要作用。在感染性疾病方面, FQ-PCR 可诊断病毒性、细菌性及寄生虫疾病。最引人注目的是将FQ-PCR 与等位基因特异性核苷酸(Allele specific oligonucleotide ,ASO) 探针技术结合检测艾滋病病毒HIV-1 ,并发现了潜伏的HIV-1 ,证明仅少数宿主细胞隐藏病毒,没有任何病毒蛋白或抗体产生。另外FQ-PCR 还可用于检测癌症残留病变和早期病变,如对急性脊髓性白血病、结肠肿瘤等的诊断。
法医学应用　FQ-PCR已经开始应用于法医学个人识别和亲子鉴定,以往法医学鉴定的生物学检测条件很差,微量生物学物质常遭破坏,给鉴定工作带来很多困难,使用传统的方法往往无助问题的解决,给法医举证带来困扰。用FQ-PCR进行DNA分型为法医学鉴定开辟了新天地,它可检测微量及降解DNA,快速、简便、识别率高。目前已有对血痕、精斑、毛发、骨及其它组织DNA 分型的研究和应用于个人识别及亲子鉴定的成功报道。准确、灵敏、快速和经济的FQ-PCR 技术已发展成为一项完全自动化的分析技术,多种分析法与FQ-PCR 的结合使其具有广阔的应用前景。
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
77

发表于 2011-8-24 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
肿瘤学研究 意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。
1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。
免疫组群分析 对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
(三) FQ-PCR 的应用前景及展望
FQ-PCR 的出现,简化了mRNA 的可重复定量和检测过程,并可精确定量。FQ-PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,结果准确,与传统RT-PCR 相比有明显的优势。因此,实时FQ-PCR 在核酸的检测应用中,在临床诊断或大规模的人群分子流行病学调查中,都有广阔的应用前景。基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的发展趋势,目前该领域的研究刚刚起步,仍有许多问题需要解决,如分析灵敏度及重复性问题、自动化仪器和试剂成本、样本处理及多基因同时分析等问题。生物芯片技术与荧光探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决。FQ-PCR 的分子灯塔技术与肽核酸技术结合,可大大增加反应的稳定性，将大大推动荧光定量检测技术在生命医学领域的应用普及。
待续
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
78

发表于 2011-8-24 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二、 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术近几年已开发应用于病原体核酸检测,已广泛应用于医学和生物学领域 ,在医学临床和研究中,也开始被推广使用。随着生物技术的快速发展 ,核酸扩增技术在医学临床与分子生物学研究领域中显示了重要作用。PCR是DNA扩增技术中应用最广泛的方法。例如 LCR(连接酶链式反应 )、SDA(链替代扩增反应 )、NASBA(依赖核酸序列扩增 )、TMA(转录介导扩增 )、bDNA(支链核酸信号放大 )、RCA(滚环扩增 )、杂交捕获、DNA裂解信号放大等 ,Taq Man荧光探针便是其中之一。Taq Man技术是从PCR衍生而建立的新的核酸扩增技术,由罗德公司( Rode Molecular System Inc.)发明并注册专利。1991年Holland等首先报道了一种不可延伸的双标记寡核苷酸杂交探针,利用DNA聚合酶的5′端外切酶活性检测 PCR产物。最初称其为实时定量PCR技术( Real-time quantitative PCR)或荧光定量PCR( FQ-PCR)。美国 Applied Biosystems公司于1996年根据上述原理开发设计了Taq Man( r)序列检测仪进行双标记荧光定量 PCR检测。不久,美国匹兹堡大学癌症研究所成立了 Tony Godfrey领导的Taq Man(r)实验室 ,对各种病原体进行临床检测使用。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃 ,而且与常规PCR相比 ,它具有特异性和灵敏性更强 ,能有效解决PCR产物污染问题,自动化程度高等特点,目前在医学和分子生物学领域已得到广泛应用。
(一) 实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5´端报告荧光基团的激发光被3´端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5´端→3´端外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，有一个报告基团的信号释放，被释放的激发离解报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。通过标准品与待测品的对数值比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
1. 定量程序
(1) Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。见图(4-5)


图(4-5) Ct值的确定
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
79

发表于 2011-8-24 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
（2） 荧光值的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SD cycle 6-15
（3） Ct值与起始模板的关系：
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如（图4-6）所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
（4） 荧光化学: 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如(图4-7)所示。


图(4-6). 荧光定量标准曲线

(5) 荧光域值（threshold）的设备 PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle 6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。
(二) 实时荧光定量PCR技术检测仪器
美国 Applied Biosystems公司推出的ABI-7700实时荧光定量 PCR仪已成为专利产品。美国应用生物系统公司( Applied Biosystems)是全球最大的生命科学仪器制造厂商,该公司由 1986年推出世界第一台 PCR仪以来,一直不断完善和开发各种分子技术诊断设备 ,1996年又推出了全球第一台荧光定量PCR仪即 ABI-7700型荧光定量PCR仪。该仪器采用488nm氩离子激光器光源, 保证高能稳定的荧光激发。它还采用了520～660nm光栅全波长荧光同时分光及CCD( Charge coupled device电荷偶联装置 )摄像机荧光检测技术。扩增系统
顶部
荷塘青蛙！[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
80

发表于 2011-8-24 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
图(4-7)

采用9600型PCR仪 ,其加热冷却速度不受环境温度影响,保证了定量 PCR的批间重现性 ,而且其热膜加热设计又保证了96个样品孔温度的高度均一性,保证了定量 PCR的批内重现性。设计了阴性内对照荧光信号自动校准程序消除管间信号差异。该仪器一次最多可同时分析 96个样品 ,全波长同时检测各种颜色荧光 ,可做管内阳性模板对照或在同一反应管内定量多个靶基因。配套软件为等位基因分析软件和引物设计软件 ( Primer Express)。在此基础上研究和开发了其他同类仪器有 ABI-79 00型、PE-5700型、Cycle iQ荧光定量 PCR仪等。
(三) 实时荧光定量PCR的特点
1. 敏感性 实时荧光定量PCR技术的敏感度通常达10²拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。同时实时荧光定量PCR应用了光谱技术,与计算机技术相结合有较多的优点,有效的减少了劳动量。如Taqman PCR使用氩激光来激发荧光的产生 ,利用荧光探测仪检测荧光信号的大小,通过计算机的分析软件进行分析,灵敏度达到了极限 ,可以检测到单拷贝的基因,这是传统的 PCR难以做到的。敏感性大大提高。
2. 特异性 实时荧光定量PCR技术具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。荧光探针的使用相当于在PCR的过程中自动完成了Southern印迹杂交,进一步提高目的基因检测的特异性。
降低产物污染的风险性 传统的PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果除了有污染外,还对人体产生一定的伤害 ,而荧光实时定量PCR在全封闭状态下实现扩增及产物分析,有效的减少了污染及对人体的伤害。在大批量的标本检测中能有效的减少劳动量。
3. 可重复性 实时荧光定量PCR技术结果相当稳定，同一标本的Ct值相同，但是其产物的荧光量却相差很大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，Ct值与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比Ct值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。同时，因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，如扩增孔间温度差异、标本中DNA聚合酶抑制剂的存在、加样的差异和待测标本中核酸模板的量等。因此，在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。
顶部
 157  8/16 |‹‹‹6789101112131415›››|