小中大实时荧光定量PCR技术是将PCR从定性检测发展到定量检测的重大飞跃 ,这无疑扩大了它的应用范围 ,也提高了其应用价值。与常规 PCR比较起来 ,它具备更为突出的优点 ,近几年国内外医学临床和实验中报导了Taq Man技术的优点，它具有良好的敏感性和特异性。特异性方面 ,用以检测病原体的拭子样品,应用 Taq Man探针和常规PCR比较,特异性分别为96.5%和92.9 % ,检测外周血样品的特异性为96.7%和95.6% ,特异性之间的差异无显著性( P >0.05)。敏感性方面 ,Taq Man技术明显高于常规PCR。据陈效友等试验结果,纯化的结核分支杆菌染色体基因组 DNA经751型紫外分光光度计定量 ,从 100ng/μL开始,10倍稀释至1fg,并对结核分支杆菌菌体进行10倍稀释 ,分别进行Taq Man-PCR检测3次,结果显示 PCR的检测灵敏度达1pgDNA和20个菌体/m L,而Taq Man-PCR的检测灵敏度达10fgDNA和 1～ 5个菌体 /m L。也就是说 ,Taq Man技术的检测灵敏度要比常规 PCR高 10～ 100倍。德国的B.Schweiger等用Taq Man-PCR检测流感病毒 A、B型和 15个亚型中,100倍稀释时,灵敏度可达0.1TCID50,近似10个病毒 DNA,而常规PCR约为100～200病毒DNA。Taq Man技术的优点还在于由于全程的闭管操作,没有 PCR的后处理过程 ,因此污染率降低,克服了常规PCR污染率高造成假阳性的致命弱点。又由于其标准曲线的动力学范围广 ,为精确定量提供了较大的可信区间。 Taq Man技术采用的是外标准曲线的定量方法 ,它比内标法和半定量法要准确得多 ,而且 ,荧光探针高度重现性的特点保证了定量检测的稳定性。另外,定量过程的全自动化、高效率为其商品化提供了可行办法。实时荧光定量PCR技术使用了“内对照”系统 ,可校正 PCR效率获得定量结果。实时荧光定量PCR技术使用即时法 ,有效地解决了传统定量只能终点检测的局限 ,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件中,Ct值代表样品的浓度 ,通过对每个样品 Ct值的计算,常规法须在 PCR完成后测出全部的 PCR产物量 ,再确定原样品浓度。实时荧光定量PCR技术无需内标而采用外标准曲线定量 ,其原理根据 Ct值的重现性以及 Ct值与起始模板的线性关系。用实时荧光定量PCR技术检测,循环数约 20～24个 ,而常规 PCR法需使用 34循环。然而 ,Taq Man技术也有其不足之处尚未解决 ,如假阴性结果,这有可能是由于扩增体系中存在抑制物( inhibitors)而导致的结果或由于部分病原体存在序列缺损,这些问题有待进一步研究。另外,Taq Man荧光探针采用了酶外切活性,因此定量时常受酶性能的影响。
(四) 实时荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术鉴定病原体的工作流程部分与常规PCR方法基本相似 ,要进行标本的前处理、DNA制备、设计引物、DNA模板扩增等。而 Taq Man-PCR使用的仪器、试剂、统计学方法不同 ,除常规引物外 ,它需设计并使用两端标记了荧光素的DNA探针,在 PCR反应体系中添加荧光染料SYBR Green I,随着产物链的延伸 ,Taq酶沿着 DNA模板移动到荧光标记探针结合位置,发挥 5′端～ 3′端外切酶活性 ,将荧光探针切断使报告荧光基团游离,然后通过Taq Man检测仪器测报告荧光信号 ,荧光信号的强弱由所测的Ct值确定,大于一定值为阳性,利用标准曲线计算出样品的起始拷贝数,进行定量分析。目前实时荧光定量PCR技术在医学和分子生物学领域已得到广泛应用,尤其是对RNA定量分析及基因遗传突变分析。主要应用于3个方面 :病原检测 (即病毒、细菌、霉菌等 )、基因表达(即细胞因子、生长因子、转录因子等 )和等位基因的鉴定(单核苷酸多态性( Single nucleotide polymorphism,SNP)的检测。在医学临床上已用实时荧光定量PCR技术诊断各种病原体 ,如流感病毒、人类免疫缺陷病毒( HIV)、结核分支杆菌、布鲁氏菌、大肠杆菌、性病病原体等。用 Taq Man技术检测致病性钩端螺旋体时可作出精确诊断 ,可避免使用 ELISA和 SAT等检测时出现假阳性的结果。通过实验和临床比较 ,常规PCR方法阳性率明显高于培养法 ,而 Taq Man技术检出标本阳性率高于常规 PCR。实时荧光定量PCR技术在兽医诊断学中也开始推广使用 ,在检测牛病毒性腹泻病毒 ( BVDV)、禽分支杆菌、牛布鲁氏菌、鹦鹉衣原体、猫冠状病毒等多种病原体的诊断和鉴别中陆续被采用。用实时荧光定量PCR技术诊断鸡新城疫和禽流感是特异性和敏感性较高的有效方法 ,并可区分新城疫病毒毒株的强毒、中间毒和弱毒株的差异。Cristian M L等已用Taq Man-PCR成功地建立了实时荧光定量检测技术及应用猫免疫缺陷病毒 ( FIV)疫苗中RNA和DNA的定量系统。实时荧光定量PCR技术还被应用于转基因食品及农产品的定量分析(如转基因大豆和玉米等 )。使用 ABI-7700型检测仪可准确测出食品中转基因成份的含量。人类基因组计划中,用实时荧光定量PCR技术可同时检测多种基因,比单独检测每一个基因提供更多有效的信息。在胚胎植入前的遗传学诊断中也使用了Taq Man技实时荧光定量PCR技术。在分子生物学中, 实时荧光定量PCR技术主要用于基因表达的定量检测和等位基因的鉴别。目前已建立了不同物种之间,基因表达定量的Taq Man PCR实时系统 ,此系统可靠性高。还可应用实时 Taq Man PCR检测基因突变和基因组的不稳定性。另外,用该技术对致癌基因进行扩增和检测肿瘤抑制子基因的缺失等。实时荧光定量PCR技术应用于SNP研究及基因表达分析包括 SNP发现(discovery)、SNP验证(validation)以及 SNP筛选( Screening or Scoring)。根据 SNP研究的不同阶段,解决方案选择包括测序法、单一核苷酸延伸法以及 Taq-Man MGB探针法。
