小中大【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...
用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,准备上离心机12,000 RPM之前,观察各EP管TRIZOL与氯仿分层情况, 发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和我的步骤有什么关键差别,现在我想,是不是差别主要在前边这几步呢?因为蛋白只会在TRIZOL和氯仿这两步除去,如果这两步效果差,那最后肯定有很多蛋白掺杂,导致纯度低.大家都是怎么做的呢?请讨论一下吧.
我的分析:
1 TRIZOL去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,TRIZOL是前三个月前订的,应该不会失效这么快.
2 TRIZOL未充分裂解,加入TRIZOL后我就用枪吹打数次, 然后间断振荡, 不知大家怎么做的?到底该怎么让其充分裂解呢? 要是提组织RNA呢?怎么让TRIZOL充分裂解组织呢?
3 氯仿去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,氯仿作为萃取溶剂,应该不存在污染失效的问题吧.
4 氯仿未充分与裂解液作用, 可是我剧烈振摇30秒,应该可以了吧?
5 加入氯仿静置时间短,导致分层不明显:同样10管,我都放了15分钟,有一管分层明显,就能够说明时间够了;
6 加入的组织过多?导致TRIZOL不能完全消化?我一般加入的组织是黄豆大小,加1毫升TRIZOL裂解,研磨消化完全后,加入氯仿,这样应该不会有问题呀?