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标题:【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

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发表于 2015-8-3 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1000000个细胞可以提出RNA吗？我提外周血单核细胞的，每次加异丙醇沉淀时可见到一层浑浊，但到最后测RNAOD值时就出现负值来，是降解了还是什么原因？
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发表于 2015-8-3 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您指的“匀浆后做一定稀释”，是从匀浆后的裂解液中取50、100、150、或200ul出来吗，那么用什么稀释它呢？稀释到多大体积，加多少体积的氯仿呢？
另外1ml的裂解液取多大的组织块最好？说明书是50-100mg，我觉得这个范围还是大些？如果大家有这方面的经验，恳请指教！！！

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我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。
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发表于 2015-8-3 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得,提取RNA正如southern 战友所说的Trizol的量要足,特别是一些含内源性RNA酶丰富的组织如肝脏、脾脏和胰腺,如果Trizol的量不足将很难彻底抑制RNA酶,也不利于RNA的提取;还有对于那些胞浆蛋白丰富的可以适当增加氯仿的用量,能使中间的分层很明显,我有时加0.25~0.3毫升的氯仿,结果也挺好的;在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸,防止吸入蛋白成分.
加异丙醇的量我们一般和前面吸取的水相大概是1:1的比例,比如吸取0.5毫升水相就加0.5毫升的异丙醇.
反正主要还是要小心操作防止RNA酶污染,特别是从氯仿和异丙醇以后的步骤,因为这时的RNA已没有了保护.
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发表于 2015-8-3 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得上面的上面的师兄说的很好,"在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸"。
我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
请多指教，谢谢！
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发表于 2015-8-3 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
请多指教，谢谢！
......

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一般来说,提取的RNA OD值偏低可能混有蛋白污染,RAN实际上在酒精洗涤时是不溶解的,应该看到的是白色沉淀,洗时我觉得应该把轻弹管壁弹能够充分洗涤.
逆转录后PCR没有产物的原因很多,不知道你有没有同时跑内参,如果能跑出内参说明你的反应体系是好的;有的RNA有轻度降解时照样能跑出内参， 但对于目的基因特别是长片段及表达不高的就困难了,能否跑出目的基因还要看退火温度,退火温度不合适,也跑不出,当然引物也有关系.
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 小中大

我观察到氯仿异戊醇很容易从TIPS上滴落一滴，就这一滴很容易部分层
在加一滴后一会就分层
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langlang[使用道具]
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 小中大
提RNA两个步骤最关键：一是组织的量和在TRIZOL中的溶解程度。100mg/1MLTRIZOL足够了。关键在于敲碎组织（一定要注意在室温中不要太久，期间可在液氮中冷却一下）和反复吹打组织块，使组织块反复通过枪头，直止看不到组织块，这个过程需要几分钟，看熟练程度了。这一步主要是保证有足够的RNA融出，保证量。第二，在加过氯仿离心吸取上清时，千万不要搅动中间的白色DNA膜状物。可50ul50ul地贴壁吸，大概总量在500UL，不要贪多，最后一下坏了一管，少50U，少不了多少RNA，这一步是保证质量。其实做的不够好是因为许多细节没有注意到。LUCK！
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woshi[使用道具]
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 小中大

提RNA确实是有很大的操作差别的，不同人做的结果就算是同一试剂，同一材料，同时做都有可能结果差别很大。对于影响结果的原因有：
1.Trizol试剂的问题，因为Trizol里面有酚，而酚是会挥发的，所以试剂保存时间不能太长，尽量避免在较高温度条件下敞口放置。（我实验室一哥们把新订的Trizol室温放置了一个晚上，后来用就不太好了）
2.操作上的问题：1）裂解细胞时一定要把细胞轻轻吹打分散开，不要有成团的，但也不可使劲吹打；2）加入氯仿后的振荡很关键，要是votex的话就过于剧烈了，应该用手使劲的上下左右振荡，这样既能尽可能的把RNA萃取出来，又最大限度的避免了基因组DNA的污染。
基本上主要的影响就是这些了，一般注意了这些就可以得到较好的重现性了。
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whitesheep[使用道具]
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 小中大

那如果组织用超声细胞仪粉碎和用匀浆有区别吗，超声粉碎会切断RNA吗
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