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标题:【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

dhpbj[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兄弟我最近在做有关脾脏组织的RT－PCR，在提取RNA的过程中几乎试遍了所有的RNA提取试剂，有一些经验与大家分享，脾脏组织的RNA提取采用TRIPURE最好，结果稳定，比值一般都在1.9－2.0左右，RNA电泳三条带清晰，而且即使5S带较亮不会影响PCR结果。脾脏组织在匀浆的时候很麻烦，一定要匀浆完毕后液体不能起丝（即匀浆棒取出时看不到明显的粘丝状），我也曾试过用超声细胞破碎仪进行匀浆效果不好，感觉RNA都被打断了，RNA电泳时只有5S带。我感觉RNA提取的关键在于匀浆这一步，其它步骤按说明书即可，最后的75％酒精洗涤最好2次。
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ending[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位高手，有没有提取胰腺rna成功的，介绍一下经验，我都做三个月了，每次提取出来的都是一条降解带带，od值在1.5左右，今天下午我换肝组织试了一下，出来的rna三条带非常清楚，应该说明我的试剂、手法没什么问题吧，可为什么换了胰腺就提不出来呢，超级郁闷，再这样下去我快熬死了！
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近也抽提了一次肾系膜细胞RNA,但是以失败告终！
把我失败的教训说一下哈：
细胞数量太少！我用的是5cm*2的培养皿，先用胰酶消化细胞，PBS终止消化，离心，再用PBS吹打，离心。弃上请，加入1mlTRIZOL，吹打一分钟。然后放入-80保存过夜。（因为时间关系，第二天中午接着做的），加入氯仿0.2ml，混匀，室温放置三分钟，四度离心，转移上层水相，加入等体积的异丙醇，离心，再加入75％的乙醇，离心。发现没有白色沉淀！
指导老师说是因为细胞数太少了，各位大侠有什么高见，请指导一下吧！
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tudou85[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提了几次RNA，都遇到同一个现象。用75%酒精洗涤时，白色沉淀全部溶解，怎么离心也见不到了。最后离心十分钟，仅剩一点液体。加20ulte后跑电泳，可见三条带。od260是0.020，280是0.140。可以做rt吗？稀释倍数是1000倍
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remenb[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tudou85 于 2015-8-3 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
提了几次RNA，都遇到同一个现象。用75%酒精洗涤时，白色沉淀全部溶解，怎么离心也见不到了。最后离心十分钟，仅剩一点液体。加20ulte后跑电泳，可见三条带。od260是0.020，280是0.140。可以做rt吗？稀释倍数是1000倍 ...

0.02/0.14？od260是0.20吧！如果是应该可以做！
一般来说加入75%酒精时我遇到过两种情况：1.RNA沉淀不溶解，吹打后仍然见到小碎片。这种情况一般OD值都很好1.8－2.0，而且RNA浓度很高，一般有50ug以上。RT－PCR也没问题。2.RNA沉淀在加入75%酒精后沉淀肉眼不可见，这种情况下，实验的结果很不稳定。个人认为还是肉眼可见沉淀较好！
另外我认为加入TRIzol的量很重要，一般做细胞的抽提，细胞数不需要10*7,也很难有这么多！所以TRIzol我只加0.75ml，氯仿相应减少为0.15ml效果很好！加入氯仿之前室温静置就可以。异丙醇和75%酒精一定要预先冷冻处理！祝大家好运！
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H2O[使用道具]
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发表于 2015-8-3 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做od时稀释倍数是1000倍，这样算下来总的rna量在16ug。细胞数用了铺满的19cm的培养瓶。电泳发现加样孔有红色荧光。说明有DNA污染。操作时很小 心的。怎么避免呢？
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