【求助】如何提取贴壁细胞中的总RNA？

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标题:【求助】如何提取贴壁细胞中的总RNA？

yonger[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位同仁：我正准备用贴壁细胞做real time PCR，之前做组织时是用TRIZOL提的总RNA，不知细胞中的RNA提取方法是否也类似？具体有些什么要求？请大家多多帮忙！祝圣诞快乐！

milkdog[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以用TRIZOLA提，说明书应该有详细介绍的

kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

当然可以用TRIZol提了，步骤比提组织的还简单，若是在6孔板内养的细胞，处理时间到了以后，直接弃上清，用PBS洗2~3遍，把PBS弃净后直接加0.5~1.0mlTRIZol，裂解4~5min后将其移入无RNA酶的EP管中，-80度保存；或者是先常规的将细胞消化下来，PBS洗2~3遍，加TRAZol裂解。

yonger[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家！可以不用消化下贴壁细胞直接裂解吗？能充分裂解吗？
请问用TRIZOL裂解时细胞的浓度大概是多少？是否需等细胞在6孔板中长满以后再加1mlTRIZOL？

gmt[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

绝对可以不用消化，直接裂解，我都做了N次了。细胞浓度和你养的细胞大小有关，有的细胞比较小，6孔板长满厚细胞数量能达到2-5×10的6次方，但若你养的细胞很不规则，单个细胞占的面积比较大的话，细胞数量就少了，一般作PCR 6孔板内的细胞就够了。细胞是否长满我觉得不是个问题，你在传代的时候细胞种的密度大一点，很快就长满了,留标本的时间是由你的处理因素决定的。

dog002[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教一下：RNA怎么进行电泳？？

chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-8-3 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天用TRIZOL提了一次，12孔板长到80%后，加500ulTRIZOL裂解。异丙醇离心后看不到沉淀。加DEPC水溶解后检测260OD值几乎为0。证明根本没有提出来RNA。怎么回事？是细胞太少了吗？

dior[使用道具]
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