小中大通常我都是先做梯度ＰＣＲ，看在某一特定温度下有无特异性目的条带出现，如果没有目的条带，我通常就考虑换引物了，如果有目的条带，但为非特异扩增，这是才会考虑Ｔｏｕｃｈ Ｄｏｗｎ，为了提高特异性，并保证产物的量，Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ通常参考梯度ＰＣＲ的结果，选择目的条带刚好看不出来的那个温度，一直降到扩增量较多的第一的较高的温度，然后剩下的循环就在该温度下完成，需要注意的是我通常做Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ时，从高温降到低温设计约１０到１２循环，以保证特异性目的条带的量比较大的情况下，非特异性带才会出现，这样特异性目的条带就会抑制非特异性片段了。至于Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ一次就可以摸索出最适条件，我认为是不妥的，只能说它有可能让你一次就拿到你的目的片段，这时如果没有梯度ＰＣＲ作参考，我通常设计高于引物Ｔｍ值３度开始降温，降到低于Ｔｍ值５度，然后完成后面的循环。所以通常我拿到引物通常都是先做梯度ＰＣＲ，在考虑Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ。因为ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ不可避免的会引入非特异性片段，尽管量比较少。
