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标题:【转帖】【分享】realtime 咖啡屋

feiya[使用道具]
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发表于 2015-8-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小弟最近也一直在做real time,我觉得引物很重要最好能在100到150bp之间，引物要经过软件验证没有发夹结构、二聚体和非特异性扩增，且尽量能够跨内含子，合成引物要是PAGE纯化级别，我觉得这点相当重要，还有就是操作要达到无菌无酶，尽可能大体积上样，两步法时，反转录时随机引物和oligo dT可以一起上，这样有助于得到全长的cDNA。
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abc816[使用道具]
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发表于 2015-8-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得最好扩增长度在100-200之间，我们实验室几乎都是在这一范围之内，片段短了容易扩增，但也不是越短越好，如果小于100的话跑电泳可能会出现目的条带和引物二聚体重叠，这样也不利于判断有没有二聚体的存在，所以我建议如果是做染料的qPCR扩增片段最好不要小于100，然而做探针的就不存在这个问题了
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abc816[使用道具]
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发表于 2015-8-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用普通的Taq没也能得到很好的效果 如楼上所说，染料法扩增片段最好不要设计太小，以100-200bp为宜，以方便与引物二聚体区分
小胶质细胞: 由于检测时，光是从管顶穿过，所以在盖管子时，一定要戴手套，尽量不要碰到。九十六孔板为了减低空泡对检测的影响，可以用离心机甩一下，要专门的离心机，注意要配平。我们一般2000转10分钟
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abc816[使用道具]
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发表于 2015-8-3 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
合成引物要是PAGE纯化级别
对于以上的问题我根据我的经验说一下.
1、引物长度我并不觉得100～200是最好的。我们实验室的基本是80多BP，特异性很好。因为，即便是做荧光染料的。引物的特异性要好。可以多设计几对，选实际效果最好的。软件有专门的软件。最好不用P5. 再就是不好区别引物二聚体，说实话，好的引物就不应该出现引物二聚体！！再就是可以通过溶解曲线分析，荧光定量PCR的优点之一就是“不用跑电泳”！！！
2、Taq酶的选择，如果你是做定量用的话，不应该用普通的，要用热启动的。防治没有正式扩增前的本低扩增。
3、盖盖子不要碰，说实话很难盖紧，卡哇伊戴手套盖，其次，放进去后可以用干净擦镜纸或者其他纸或布擦一下。
4、对于处气泡。用大的，可离心酶联免疫板的那种离心机，低转速0.5～1min就差不多了。没必要那么长。
5、对于很多个样，如果条件允许的话可以用“自动加样工作站”。编好加样程序就不会错了。没有的话就要小心了，不能分心。加样的时候一边加一边可以默念样品与八连管的编号，例如：9号样对应2排1号管，就可以念：9对2.1.
6、现在的MasterMix都比较便宜了，比自己配的稳定，重复性好，我觉得买得起定量PCR仪的应该都可以买的起。
7、引物合成，根据我们实验室三四年的经验，按普通引物合成的那种就可以了，高规格的很贵，尤其是TAKARA的，上次跟我说做定量的要4块一个碱基。没那个必要浪费钱。
特异性高才是王道！！！
仅供参考！！
祝：实验顺利！
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发表于 2015-8-3 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下“”是什么意思啊？谢谢了小弟想好好再学习一下。
　引物特异性高应该是基础吧，引物的其它限制条件都是建立在此基础之上的，但我还是觉得这是相辅相成的。
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abc816[使用道具]
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发表于 2015-8-3 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 eor 于 2015-8-3 18:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下“”是什么意思啊？谢谢了小弟想好好再学习一下。
　引物特异性高应该是基础吧，引物的其它限制条件都是建立在此基础之上的，但我还是觉得这是相辅相成的。 ...

那些只是想加颜色突出一下，却没有加上。
抱歉我可能没有说清楚！各个条件确实是相辅相成的，谢谢你的提醒。
我想表达的意思是：只要引物设计好（特异性，二级结构、TM值。。。）了，其他的问题就好解决了。
建议：
1、用好点的引物或者探针设计软件：有的师兄是用的P5设计然后用Oligo6。0以上版本验证的。我也是同门师兄，研究生就做定量PCR，毕业了现在在 Bio-Rad 公司（成都）负责整个西南地区的技术支持。他们用的是Beacon Designer的软件设计的。
2、可以多设计几对，反正合成引物也不贵，因为那些东西比较只是软件评估的，跟实际情况还是有很大差别的，而且就算通过Blast比对之后没有同源性的，也有可能产生非特异性带。我们遇到过这样的情况。所以还是要通过实验检测实际的情况。选择比较好的那一对。而且节约实验，如果你设计一对等合成回来要1周，验证不行又要从新设计在合成，还不如一次多设计几对。
祝：节日快乐，实验顺利。
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发表于 2015-8-3 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征
推荐两篇经典qPCR数据统计文献。
METHODS 25, 402–408 (2001)
Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ddCT Method
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11846609')
Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e45
A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR
cuturl('http://nar.oxfordjournals.org/cgi/reprint/29/9/e45')
看完后应该就明白为什么qPCR产物要比较短，如果无法设计成比较短的产物，应该如何处理等等。（第一篇google一下篇名能查到，第二篇是免费的）
我觉得做qRT-PCR比常规跑胶传统RT-PCR还要省事，并且不光是省事，更重要的是准确。传统RT-PCR的一些要求在qRT-PCR上照样要求，并且省去了传统RT-PCR的好多要求，如：循环数的选择、上样量的准确、成像条件的一直等等可能干扰半定量准确性的因素，因为这些因素已经在qPCR中不存在了。
建议大家还是看一下qPCR的数学原理和化学原理，从理论上解决问题。
再者，对使用的qPCR仪性能和条件要有一定了解，比如，摄影家虽然对很多照相机都熟悉，但还是用自己熟悉的相机才能拍到好的相片，并且，相机只是工具，关键还是摄影家对摄影的理解。
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发表于 2015-8-3 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，做realtime-pcr的时候好的引物是很重要的，如果引物好的话，就是实验的条件差点也可以做出来。你可以在一些好点的杂志上，如影响因子高的杂志上找别人做的引物去合成，实验成功的机会就会高点，如果没有人做，你可以多合成几个，这样就算一个不好，还可以接着用下一个，不用等合成的时间了。
2，realtime-pcr加样的时候要小心啊，最好在一个没人影响你的地方加样，这样就没有人打扰你了，加样错的机会就会小点，呵呵。
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发表于 2015-8-3 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也谈谈我的经验：
　　1、CDNA的质量要保证。
　　2、设计引物用primer express。引物跨外显子，引物不形成二聚体－－这一点在用SYBGreen法时很重要。
　　3、先在纸上画好要加样的管的编号，加样时每加一个样可读一下编号来防止误加（少加或多加）。
　　4、不同意Clongene关于加样的观点。加样准确很重要。要用好的枪头。
尽可能保证在内参管里所含的模板量与目的基因中管内的模板量相同。同意
bingsenxu的做法－－最后加引物。
        5、上样结束后快速离心一下。
　　6、设运行程序后要确认无误后开始运行。
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loli[使用道具]
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 小中大
不知不同意我什么观点？
我只在下面的帖子里面提了一下我的观点。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=10458714&sty=3&keywords=%BC%D3%D1%F9')
我依然依然建议这样的观点：尽量减少2ul以下操作，可以将引物和模板做一定的稀释，加5ul。
20ul体系
引物 5ul
模板 5ul
2xMix 10ul
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