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标题:【转帖】【分享】realtime 咖啡屋

loli[使用道具]
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再说加样
谁都知道加样越准确越好,什么实验也是如此,关键是如何加准确,上面提到一些方式可以借鉴一下。
我觉得加样准不准与操作细节有一定的关系,有时细节直接导致结果的准确性,甚至“细节决定成败”。上面提到的方法基本都可以采用,可以根据自己对实验的理解,建立自己的加样方案,个人习惯而已。
我的几点建议:
1、上面提到的减少2ul以下操作,引物和模板做一定稀释后,可以根据自己的摸索的加样量,可以加3ul、4ul、5ul等,总比你取2ul以下好,只要终浓度是你想要的浓度即可。
2、固定使用移液器,虽然都是20ul的移液器,可能会有细微的差别,减少不同批次之间的差异,使结果更加准确。
3、取液体时,先在液体里面吸打一次液体,类似润洗作用,虽然进口枪头挂壁低,也不是没有挂壁的。对同一枪头吸取多次液体尤为重要。所以枪头是不是进口的并不重要,重要的是每一次、每一批加样量一致。
4、移液器要按照规范操作,尤其是调整刻度时,都要遵循由大到小调。
是不是加到管壁上,不同的人看法不一致,我都是加到管壁上的,不喜欢可以不这样操作,呵呵。
个人经验,供大家参考。
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shkudo[使用道具]
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楼上说的比较详细,也挺规范,不过我有些偷懒,所有孔都不润湿算了,一次做那么多样要加工,润湿麻烦了点,哈哈
3、先在纸上画好要加样的管的编号,加样时每加一个样可读一下编号来防止误加(少加或多加)。
这个办法挺好,我想试试,不过又怕说话唾沫星飞进加样板,不知道有没有更好的办法呀
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555444[使用道具]
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如果仔细观察的话,有的PCR加样板上横排标有"1、2、3、4、5……",竖排标有"A、B、C、D、E……"。我经常用Marker笔将它们涂上颜色,然后用酒精洗掉多余的颜色,那些标记就露了出来。
加样之前,先想好每一个PCR管加什么样;加样的时候在心里默念"A1、A2、A3、A4、A5……”。精神要集中,不然象数羊一样,一不小心就睡着了,呵呵。而且这时谁找我说话我都当没听见,不然一打岔,数到哪都不知道……
如此操作,经常几十、上百个的加样,倒还能得心应手。
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october7[使用道具]
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不知不同意我什么观点?
传统RT-PCR的一些要求在qRT-PCR上照样要求,并且省去了传统RT-PCR的好多要求,如:循环数的选择、上样量的准确、成像条件的一直等等可能干扰半定量准确性的因素,因为这些因素已经在qPCR中不存在了。
不同意上样量的准确在qPCR中不存在这个观点
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bring[使用道具]
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原理如下:
The assay takes advantage of an environmentally sensitive fluorescence dye, such as Sypro Orange, and follows its signal changes while the protein undergoes thermal unfolding. When Sypro Orange is added to a properly folded protein solution, it is exposed in an aqueous environment and its fluorescence signal quenched. As the temperature rises, the protein undergoes thermal unfolding and exposes its hydrophobic core region. Sypro Orange then binds to the hydrophobic regions and becomes unquenched. This will result in the increase of fluorescence signal of Sypro Orange.
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vvmmoy[使用道具]
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如果仔细观察的话,有的PCR加样板上横排标有"1、2、3、4、5……",竖排标有"A、B、C、D、E……"。我经常用Marker笔将它们涂上颜色,然后用酒精洗掉多余的颜色,那些标记就露了出来。
加样之前,先想好每一个PCR管加什么样;加样的时候在心里默念"A1、A2、A3、A4、A5……”。精神要集中,不然象数羊一样,一不小心就睡着了,呵呵。而且这时谁找我说话我都当没听见,不然一打岔,数到哪都不知道……
如此操作,经常几十、上百个的加样,倒还能得心应手。
......

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我们实验室的那部机只能用八联管,标记比较麻烦,所以我们一般都是先拿张纸写好顺序,然后在八联管的一头写上编号,这样就不会混了。关于盖盖子的问题,我们一贯的做法是戴一新的薄膜手套来按压盖子,千万不能用胶手套,因为它上面有一层粉,很容易弄到盖子上面去,影响实验。
同样加样的时候坚决不跟人说话,这点很重要,不然很容易出错的。枪头个人认为还是进口的比较好,相对准一些,想想那些试剂那么贵(一个Mix,5ml就三千多),比起来枪头便宜多了,如果因为枪头的问题,浪费了其他试剂,不是更不划算。吸试剂之前要先看看枪上的刻度是不是自己想要的,吸的时候一定要慢,打的时候一定要一口气打到底,不然那么少的东西很容易就粘在枪头上打不出去。
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cbou876[使用道具]
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不知道有没有做多重荧光定量PCR (Taqman探针法的),如果有的话,可以交流下。
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