小中大【求助】5‘RACE 紧急求助
本人3’端已经测出来了，现在做5‘端，却怎么也扩不出来。5'RACE做了两轮pcr，用的都是以下程序：即1、94度2分钟。2、94度30秒，72度3分钟，5cycle。3、94度 30秒，70度30秒，72度3min，5 cycle。4、94度30秒，68度30秒，72度3分钟，25cycle。最后，72度7min延伸。（这个是BD公司提供的程序）
做第一轮pcr的时候有条带，但是鉴定不是我要的。第二轮pcr的时候好像隐约有目的条带，但是不亮，很微弱。对了，我把第一轮的产物稀释了100倍，第二轮成糊状。
内外2个引物的TM值设计的时候都接近70度，按照要求设计，可是合成出来后引物单子上是63.62度。
是不是程序不合适？
请各位给一些建议，本人在此谢谢大家啦。
