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标题:【求助】同样条件PCR又扩不出来了，为什么？

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】同样条件PCR又扩不出来了，为什么？


我根据基因间重复序列设计引物，对大肠杆菌基因组进行扩增，前几天都扩出来，可这几天用同样的条件，相同的体系括了好几次都没扩出来，不知道什么原因，哪位高人能帮忙分析一下可能是什么原因。pcr体系：50微升体系，Taq 0.5微升；10*PCR Buffer 5微升；dNTP 4微升，引物 20pm; 模板 2.5微升，无菌水37微升。条件：94℃,10min; 94℃, 1min; 42℃,1min; 72℃,8min; 72℃,15min,2-5步循环35 次
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ujne[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同是天涯沦落人呀，我也碰到了同样的问题，突然间同样的条件就怎么也扩不出来了，俺都快崩溃了。
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发表于 2015-8-5 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶也是,PCR就是这个样子哦
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发表于 2015-8-5 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是啊，明明同样的条件，就是p不出来了。引物，酶，buffer，dntp全换了新的。。温度也做过梯度，浓度也做过。。怎么都出不来。。电泳maker很清楚，也不是电泳的问题。。。。。晕死了
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

换比较好的酶试试。做阳性对照。如果还不行，重新设计引物了。
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tudou85[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般能P出来。偶尔出不来，以下几点分析：
1、基因组变性95度，试试
2、枪不准。特别是酶，由于不准，加的少了，就加2次
3、PCR管与仪器接触不紧密，散热不好
4、50体系比100体系散热好
5、使用降落PCR在很大的合适温度范围内
6、平行做几管，即使一管没出来，另一管也能出来
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发表于 2015-8-5 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是啊,郁闷死了,不知道你们现在都解决了没有.
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gmt[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是遇到这种情况,现在天天跑,天天没结果,都快疯了.哪位高人来指点一下吧.
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newway[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这也是，同样的条件就是做不出来呵呵
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2015-8-5 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到过这种情况，真郁闷呢！我做的是RT-PCR，我怀疑是不是与前面的RNA提取及cDNA合成均有关系。因为不同批次、即使是同一批的不同组，可能加试剂等的手法也不是没有半点差别的。这种实验真是烦！
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