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标题:【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带

txwuyan[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你先看下设计，可能不太好，如能确定这个亮的是杂带，那就提高温度吧，一般小的杂带是比较麻烦点。你的阳性也有两条哦。还是看看设计吧！还有这样的BLAST结果什么都不能说明的！
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987789[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天又跑了，退火温度由60°升为62°，好像非特异少了一条。但是非特异还是比特异的亮


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2015-8-5 15:33
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987789[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我可以可以把目的条带切胶回收后再扩啊
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ujne[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的条带很弱，不知道回收结果怎么样，可以不回收，直接当模板做一下。
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bring[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min
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987789[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bring 于 2015-8-5 15:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min ...

可以考虑减低引物的量，降引物终浓度05uM
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bring[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先谢谢师兄的回复，我用的引物是稀释到20um的然后在20ul体系里面加0.8或1ul的，该是1um吧
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tudou85[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可做一个梯度PCR，这样可以把退火温度的范围扩到10度左右，比如56℃～66℃或者60℃～70℃之间，如果还是没有结果，那么应该不是退火温度问题，可能是引物本身的问题。另外，体系要合理，特别是Mg与Taq的量过大，好像也可能扩非特异性条带的。细节也要注意，包括严格处理所用的管与枪头，加样准确，在干净的环境中加样，等等。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢！呵呵!我得引物是从文献上找到的他能扩的出来按理我也应该可以把
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jude[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议重新设计引物，没必要再做太多无谓的尝试
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